銅綠假單胞菌PA0745基因突變株的構(gòu)建及鑒定

盧培林，劉 利，熊 霞

(西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院皮膚科，四川瀘州 646000)

銅綠假單胞菌是一種革蘭陰性需氧菌，普遍存在于土壤、水、空氣和多種動物體內(nèi)，具有較強的環(huán)境適應性和耐藥性，可引起泌尿系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)感染等，是慢性皮膚潰瘍創(chuàng)面感染最常見的細菌。尤其在合并有基礎(chǔ)疾病或免疫力低下時，如患有艾滋病、糖尿病和癌癥等，病死率將大大增加。此外，由于銅綠假單胞菌耐藥性強、耐藥譜廣，對多種抗菌藥物表現(xiàn)出天然或獲得性耐藥，可供選擇的有效抗菌藥物很少。因此，從根本上尋找新的抗銅綠假單胞菌感染途徑具有重大意義[1-2]。

研究顯示，銅綠假單胞菌耐藥性的產(chǎn)生與生物膜的形成息息相關(guān)。其中，臨床分離的銅綠假單胞菌PA14細胞株可產(chǎn)生一種擴散信號分子(diffusible signal factor,DSF)類的小分子化合物順式-2-癸烯酸(cis-2-decenoic acid，CDA)，CDA可有效擴散PA14細胞株形成的生物膜，增強銅綠假單胞菌的致病性和耐藥性。相關(guān)研究表明，烯酰輔酶A水合酶/異構(gòu)酶是CDA合成過程的關(guān)鍵酶[3-6]。當PA0745基因功能受到抑制時，CDA合成受阻，銅綠假單胞菌菌膜擴散能力減弱，致病性下降。當外源性加入CDA時，菌膜運動能和細菌侵染力又得以恢復。另有研究表明，PA0745基因結(jié)構(gòu)中有兩個保守的谷氨酸殘基對行使其催化功能具有重要意義，他們分別是α3上的Glu126和α4上的Glu146[7-9]。本研究利用同源重組的原理構(gòu)建 PA0745基因點突變株E126A、E146A和基因缺失株ΔPA0745，通過生長曲線測定和細胞侵染實驗初步驗證了PA0745基因?qū)︺~綠假單胞菌致病性的影響。銅綠假單胞菌突變株的構(gòu)建有助于開展銅綠假單胞菌功能組學研究和抗菌藥物的開發(fā)。

表1 銅綠假單胞菌PA14突變株構(gòu)建所用引物表

up：上游；down：下游

1 材料與方法

1.1材料 大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞購自北京天根生化科技有限公司，S17-1由四川大學包銳研究員惠贈，銅綠假單胞菌PA14細胞株和穿梭質(zhì)粒PEX18Gm均由四川大學王震玲教授惠贈。其中，PEX18Gm質(zhì)粒含有負選擇性標記基因SacB，含有慶大霉素(Gentamicin,Gm)抗性基因。

1.2主要試劑及引物 DNA聚合酶(Q5TMHot Start High-Fidelity DNA Polymerase)購自北京NEB公司，同源重組酶(ClonExpressTMⅡ One Step Cloning Kit)購自南京Vazyme公司，磷酸化酶(Blunting Kination Ligation Kit)購自日本TaKaRa公司，限制性內(nèi)切酶(Dpn Ⅰ)購自美國Thermo Fisher Scientific公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司，抗生素購自北京天根生化科技有限公司，蛋白胨、酵母提取物購自英國Oxoid公司。引物合成和DNA測序由擎科生物科技有限公司完成，引物序列見表1。用Primer Priemier5.0軟件，根據(jù)銅綠假單胞菌PA14株染色體上PA0745基因上下游序列，設(shè)計包含其上下游同源臂序列(800 bp)的引物、點突變引物和PA0745基因敲除引物。

1.3方法

1.3.1重組質(zhì)粒PEX0745(PEX18+PA0745-up+PA0745+PA0745-down)的構(gòu)建[10]

1.3.1.1制備線性化載體PEX18Gm 以PEX18Gm質(zhì)粒為模板，以PEX18Gm-up和PEX18Gm-down為引物，用DNA聚合酶擴增質(zhì)粒PEX18Gm，PCR反應條件如下：98 ℃ 30 s，98 ℃ 10 s，62 ℃ 25 s，72 ℃ 5 min，30個循環(huán)，72 ℃ 5 min。反應體系為25 μL，取5 μL PCR產(chǎn)物進行PCR鑒定。為了提高后期重組效率，需用限制性內(nèi)切酶Dpn Ⅰ去除未線性化的環(huán)狀質(zhì)粒，條件如下：37 ℃ 2 h，80 ℃ 20 min。

1.3.1.2制備含目的基因上下游片段的PA0745-up+PA0745+PA0745-down 以PA14細胞株的DNA為模板，使用引物PEX0745-up和PEX0745-down擴增含上下游片段的PA0745-up+PA0745+PA0745-down，PCR反應條件如下：98 ℃ 30 s，98 ℃ 10 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，32個循環(huán)；72 ℃ 5 min。反應體系為25 μL，取5 μL進行PCR鑒定之后，再進行測序驗證。

1.3.1.3利用重組酶連接目的片段和載體得重組質(zhì)粒PEX0745 將克隆載體PEX18Gm和插入片段PA0745-up+PA0745+PA0745-down以摩爾比為1∶2的比例混合，利用重組酶進行重組反應得重組質(zhì)粒PEX0745。反應條件如下：37 ℃ 30 min，4 ℃ 5 min。取5 μL進行PCR鑒定后，再進行測序驗證。

1.3.2PA0745基因突變質(zhì)粒E126A、 E146A和ΔPA0745的構(gòu)建 以重組質(zhì)粒PEX0745為模板，分別使用對應引物擴增出發(fā)生126位點突變、146位點突變和PA0745基因缺失的重組質(zhì)粒E126A、E146A和ΔPA0745。PCR反應條件如下：98 ℃ 30 s，98 ℃ 10 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。取5 μL PCR產(chǎn)物進行PCR鑒定之后，進行測序驗證。為了去除PCR產(chǎn)物中的質(zhì)粒模板，需要對其進行Dpn Ⅰ酶切，條件如下：37 ℃ 2 h，80 ℃ 20 min。對酶切產(chǎn)物進行磷酸化及連接，反應條件如下：25 ℃ 5 min，16 ℃ 1 h。

1.3.3采用等位基因替換原理構(gòu)建銅綠假單胞菌PA0745基因突變株 PEX18Gm為穿梭質(zhì)粒，它可以通過結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法從大腸桿菌S17-1轉(zhuǎn)移至銅綠假單胞菌，然后整合到其基因組中。PEX18Gm攜帶可以在大腸桿菌中用于質(zhì)粒復制的復制子、Gm抗性基因和帶有具有負選擇性標記的基因SacB?；阢~綠假單胞菌可以利用檸檬酸作為碳源，而大腸桿菌不可以這一特點，利用僅含檸檬酸作為碳源的培養(yǎng)基VBMM作為第1次同源重組的篩選。另外，SacB基因的表達產(chǎn)物是果聚糖蔗糖酶，30 ℃條件下能催化蔗糖水解生成對大腸桿菌有致死作用的果聚糖。因此，SacB基因的表達會殺死生長在含有蔗糖培養(yǎng)基上的大腸桿菌，可以用做第2次同源重組的篩選。

分別將成功制備的重組質(zhì)粒E126A、E146A和ΔPA0745轉(zhuǎn)化到大腸桿菌S17-1感受態(tài)細胞中，后涂布于含有30 μg/mL Gm的LB瓊脂板上，37 ℃培養(yǎng)過夜。

用LB培養(yǎng)基1∶1稀過夜培養(yǎng)的銅綠假單胞菌PA14細胞株，于42 ℃環(huán)境熱阻斷3～6 h，以體積比為1∶6的比例與對數(shù)期供體菌S7-1混合，用濾器過濾使細菌置于濾膜上，再把濾膜貼于LB瓊脂板上，30 ℃孵箱孵育過夜。

1.3.4銅綠假單胞菌PA14突變株篩選鑒定 首先，利用含50 μg/mL Gm的VBMM瓊脂糖平板進行第1次同源重組篩選；其次，利用含10%蔗糖的NSLB瓊脂糖平板進行第2次同源重組篩選；最后，利用PIA瓊脂糖平板分離銅綠假單胞菌，進行測序驗證，得到銅綠假單胞菌PA14突變株E126A、E146A和ΔPA0745。

1.3.5銅綠假單胞菌PA0745基因突變株的生物學特性

1.3.5.1生長曲線測定 將銅綠假單胞菌PA14細胞株及其突變株E126A、E146A和ΔPA0745的過夜菌，分別按照1∶100的比例加入到3 mL新鮮的LB培養(yǎng)基和20% LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)2 h和3 h后，測OD600值，以后每0.5 h取樣，測OD600值，繪制細菌體外生長曲線。

1.3.5.2細胞侵染實驗 用含10% 胎牛血清(FBS)無抗生素的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整對數(shù)期的銅綠假單胞菌PA14細胞株及其突變株E126A、E146A和ΔPA0745OD600為0.1，首先，細菌與巨噬細胞RAW264.7按照10∶1的感染復數(shù)(MOI)混合，37 ℃共孵育1 h。其次，培養(yǎng)基替換成含10% FBS和150 ng/mL Gm的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃孵育1 h，用以除去細胞外銅綠假單胞菌。最后，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗后，0.5% Triton X-100裂解細胞，梯度稀釋后，涂布于LB瓊脂糖平板上，次日對進入細胞內(nèi)的細菌進行計數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1重組載體的鑒定 以重組質(zhì)粒PEX0745為模板，擴增出PA0745基因點突變株的質(zhì)粒E126A、E146A和基因缺失株APA0745，并測序，測序結(jié)果與預期結(jié)果一致，見圖1。

1：PA0745基因和其上下游800 bp片段；2：PA0745基因的上下游800 bp片段；3：pEX18Gm質(zhì)粒線性化

圖1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜

2.2PA14細胞株的PA0745基因突變株的特性 分別測試了PA14細胞株的PA0745基因突變株E126A、E146A和ΔPA0745在營養(yǎng)充足(LB)和營養(yǎng)缺陷(20% LB)的環(huán)境下的生長曲線。細菌在20% LB的生長條件下，8 h后細菌達到生長平臺期，OD600為1.5左右，而在營養(yǎng)充足的LB生長條件下，8.5 h后細菌達到生長平臺期，OD600為2.0左右。但不論細菌是在LB培養(yǎng)基中還是20% LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，PA14野生型菌株與突變株生長并沒有差異，說明PA0745基因突變后不影響PA14細胞株的生長，見圖2。

圖2 銅綠假單胞菌PA14細胞株及突變株在LB(A)和20% LB(B)中生長曲線

2.3突變PA0745基因抑制銅綠假單胞菌細胞侵染能力比較 PA0745基因敲除后，銅綠假單胞菌侵入細胞的能力相較于野生型PA14細胞株下降了79.34%，具有催化活性的126、146位谷氨酸分別突變成丙氨酸后，相較于野生型PA14細胞株，細菌侵染能力也分別下降了29.51%及60.66%，見圖3。

圖3 銅綠假單胞菌PA14細胞株及其突變株侵染巨噬細胞RAW264.7能力比較

3 討 論

慢性皮膚潰瘍創(chuàng)面為銅綠假單胞菌的存活提供良好的“培養(yǎng)基”，使創(chuàng)面遷延不愈。而在近年相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)巨噬細胞在創(chuàng)面愈合過程中起總指揮的作用，當細菌大量繁殖擴增，使局部炎性反應及細胞因子的生物學效應減弱，影響巨噬細胞對抗炎和促進修復的調(diào)控。這為臨床醫(yī)生對慢性皮膚潰瘍細菌感染的抗菌治療提供理論依據(jù)[11]。

本研究通過同源重組的原理成功構(gòu)建了銅綠假單胞菌PA0745基因突變株：E126A、E146A和ΔPA0745，通過生長曲線測定，各突變株與野生型PA14菌株之間并無明顯差異，說明PA0745基因的功能缺失并不影響PA14細胞株的生長。通過巨噬細胞侵染實驗考察PA0745基因?qū)︺~綠假單胞菌致病性的影響，發(fā)現(xiàn)相較于野生株P(guān)A14，PA0745基因各突變株的細胞侵染能力均出現(xiàn)了不同程度的下降。上述實驗結(jié)果表明，以生物膜擴散信號分子形成過程中的關(guān)鍵酶為靶點，設(shè)計抗菌藥物的可行性，由于它僅抑制細菌的致病性而不直接殺死細菌，這種抗菌藥物將大大降低耐藥菌株的產(chǎn)生。同時本實驗從細菌侵染宿主方面證明了PA0745基因作為抗菌藥物靶點的潛力，為開發(fā)針對PA0745基因靶點的新型抗菌藥物提供理論基礎(chǔ)[12]。

本研究針對銅綠假單胞菌生物膜擴散信號分子CDA生物合成的關(guān)鍵酶PA0745基因的功能展開了研究，在后續(xù)工作中，本課題組將通過對比分析銅綠假單胞菌野生型PA14和PA0745基因敲除株基因表達譜，深入研究CDA在銅綠假單胞菌內(nèi)參與調(diào)控的下游信號通路，以期為以PA0745基因為靶點的小分子抑制劑的篩選提供理論基礎(chǔ)和可行性分析。

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