miRNA-129-5p干擾技術對膽道閉鎖小鼠膽道EMT作用機制的研究*

王建堯，王 斌△，吳宙光，葉曉爍，陳子民，馮 奇，劉 冬，姚 君

(1.廣東省深圳市兒童醫院普外二科 518000；2.廣東省深圳市人民醫院消化內科 518000)

膽道閉鎖是嬰兒期累及肝內外膽管、最終導致終末期肝硬化的嚴重肝臟疾病[1-4]。miRNA-129-5p是新近發現的一個與纖維化疾病緊密相關的小分子RNA(miRNA)家族，在多種器官纖維化的調控中發揮著重要作用[5-8]。在膽道閉鎖膽管上皮細胞纖維化過程中，上皮間質轉化(epithelium-mesenchymal transition，EMT)機制發揮著至關重要的作用[9]。本研究將構建TGF-β1誘導的小鼠膽管EMT分化細胞模型，檢測TGF-β1刺激后膽道上皮細胞株EMT相關標志物及細胞外基質(ECM)表達水平，并檢測miRNA-129-5p的表達變化，探討miRNA-129-5p調控EMT的機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物與試劑 動物BALB/c小鼠[廣東省醫學動物實驗中心，SCXK(粵)2014-0035]，5周齡；Trizol(美國Invitrogen公司)；DNA熒光染料SYBR Green Ⅰ(美國Invitrogen公司)；引物(美國Invitrogen公司)；RNA酶抑制劑(美國Invitrogen公司)；Taq酶(美國Invitrogen公司)；10×buffer(美國Invitrogen公司)；5×buffer(美國Invitrogen公司)；LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)；DMEM培養基(美國Gibco公司)；Pre-miRTMmiRNA-129-5p(美國Invitrogen公司)；Pre-miRTMmicroRNA Precursor陰性對照(美國Invitrogen公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物有限公司)；重組人TGF-β1(美國Santa cruz Biotechnology公司)；小鼠抗人β-actin單克隆抗體(美國Santa cruz Biotechnology公司)；兔抗人鈣黏蛋白(E-cadherin)多克隆抗體(美國Santa cruz Biotechnology公司)；山羊抗人claudin1多克隆抗體(美國Santa cruz Biotechnology公司)；小鼠抗人波形蛋白(Vimentin)單克隆抗體(美國Santa cruz Biotechnology公司)；兔抗人FN多克隆抗體(美國Santa cruz Biotechnology公司)；辣根過氧化物酶標記抗山羊二抗(美國Santa cruz Biotechnology公司)；辣根過氧化物酶標記抗山羊二抗(美國Santa cruz Biotechnology公司)；miRNA提取試劑盒(美國Applied Biosystems公司)；miRNA反轉錄試劑盒(美國Applied Biosystems公司)；實時熒光定量PCR (RT-PCR)試劑盒(美國Invitrogen公司)。

1.2方法

1.2.1膽道閉鎖動物模型構建及肝臟蘇木精-伊紅(HE)染色 根據國內湯紹濤等[10]的造模方法，將BALB/c小鼠30只按照雄雌比例1∶3分籠飼養，待生下第1胎新生鼠后分2組，給新生12～18 h BALB/c小鼠經腹腔內分別注入生理鹽水(對照組)和輪狀病毒(實驗組)，于注射后14 d取肝臟及膽管組織，連續切片行HE染色。

1.2.2RT-PCR檢測miRNA-129-5p的表達變化 分別取兩組小鼠膽管組織置于-70 ℃保存備用，切取部分標本后，每份稱量50 mg置于玻璃勻漿器中，依照mirVanaTMmiRNA Isolation Kit說明書進行總RNA提取，將提取物于-70 ℃保存。

RT reaction master mix的合成按照TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit說明書的步驟合成，總反應體系為7.00 μL，其中0.15 μL 100 mmol/L dNTPs，1.00 μL MultiScribeTMReverse Transcriptase，1.50 μL 10×Reverse Transcription buffer，0.19 μL 20 U/μL的RNAse Inhibitor，4.16 μL無核酸酶水。

cDNA的合成按照TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit說明書的步驟合成，總反應體系15.0 μL，其中7.0 μL RT reaction master mix，3.0 μL RT590，5.0 μL總RNA。RT反應程序：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，置冰上冷卻，-20 ℃保存。

PCR總反應體系20.00 μL，其中1.00 μL Taqman 590,1.33 μL RT反應標本，10.00 μL TaqMan 2*Universal PCR Master Mix，7.67 μL 無核酸酶水。反應程序：95 ℃ 10 min熱啟動;95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min擴增40個循環；每次PCR均設去離子水為模板的陰性對照。

1.2.3TGF-β1誘導后細胞中miRNA-129-5p及EMT標志物表達的變化 將對照組小鼠膽管上皮細胞進行體外分離，并進行傳代培養，流式細胞儀鑒定分離培養的膽管上皮細胞。待細胞長至80%融合時進行消化，加培養基終止后，用血球計數板行細胞計數，調節細胞濃度為1×105/mL接種到6孔培養板。待細胞長至約70%～80%融合時，進行干預實驗。

提取5 ng/mL TGF-β1刺激后，分別于0、12、24、48和72 h通過RT-PCR及Western blot檢測膽管上皮細胞中miRNA-129-5p、FMNL2、Vimentin蛋白、E-cadherin、細胞角蛋白-19(CK-19)的表達。

1.2.4通過細胞轉染技術過表達miRNA-129-5p，檢測膽道EMT的變化

1.2.4.1分組 (1)空白組：TGF-β1干預終濃度為5 ng/mL，刺激時間為48 h；(2)干預組：預先用50 nmol/L的pre-miRNA-129-5p干預24 h后，再以5 ng/mL的TGF-β1對細胞進行48 h刺激；(3)陰性干預組：預先用50 nmol/L的pre-mir陰性對照干預24 h后，再以5 ng/mL的TGF-β1對細胞進行48 h刺激。

1.2.4.2細胞轉染 按LipofectamineTM2000說明書進行細胞轉染。轉染前1 d，接種適當數量膽管上皮細胞至6孔板中，每孔加入不含抗菌藥物的DMEN完全培養基2 mL，使轉染時細胞密度能達到30%～50%。將pre-mir-lip2000混合物加入含有細胞及細胞培養液的6孔板中，搖動混合。同時以等量opti-MEMI低血清培養基設置空白對照孔。將6孔板置于5% CO2，37 ℃孵育6 h后換成DMEM完全培養基，孵育24 h后換液。

1.2.4.3免疫熒光法檢測EMT相關蛋白的表達變化 從孵化器和蓋玻片取出6孔板，預冷的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗10次。吸取多余的液體，用4%多聚甲醛2 mL室溫下固定10～15min。吸干固定液，加入滲透液(0.1% TritonX-100/PBS)室溫孵育10 min。吸干滲透液，置于搖床PBS清洗3次，每次5 min。吸干封閉液，加E-cadherin(1∶30稀釋)、CK-19(1∶50稀釋)、FMNL2(1∶30稀釋)、Vimentin(1∶50稀釋)，室溫下置于搖床上孵育1 h后置于4 ℃孵育過夜，孵育在濕盒內進行。吸出一抗稀釋液，置于搖床上PBS清洗3次，每次5 min。滴加異硫氰酸熒光素(FITC)標價的二抗，室溫避光孵育30 min；Hoechst33258染核10 min。吸出二抗稀釋液，置于搖床上PBS清洗3次，每次5 min。Fluoro-gel Ⅲ封片，于熒光顯微鏡下觀察并且拍照。激光掃描共聚焦顯微鏡檢測FMNL2、Vimentin、E-cadherin和CK-19的表達。

2 結 果

2.1小鼠肝臟HE染色特點的結果 對照組中小鼠肝臟HE染色未見明顯異常；實驗組小鼠肝臟明顯黃染發暗，質地明顯發硬，表面呈顆粒狀，同時膽囊萎縮，而肝外膽道呈閉鎖或索條狀狹窄。HE結果顯示，大量的炎性細胞浸潤肝內門脈系統，伴有明顯的肝內膽汁淤積，同時有點片狀壞死，見圖1。

A.正常膽管，正常肝臟匯管區炎性細胞極少；B.膽管呈閉鎖狀態，內皮細胞破壞，不規則增生，伴炎性細胞浸潤，肝臟中可見匯管區炎性細胞明顯浸潤

圖1小鼠肝臟HE染色(×100)

2.2各組小鼠膽道組織中miRNA-129-5p的表達 與對照組比較，miRNA-129-5p在實驗組小鼠膽道上皮組織中的表達顯著降低(P<0.01)，見圖2。

圖2 兩組小鼠膽道組織中miRNA-129-5p的相對表達水平

2.3TGF-β1誘導后細胞中miRNA-129-5p及EMT標志物表達變化 TGF-β1誘導后膽道上皮細胞中miRNA-129-5p的表達水平呈時間依賴性下降，見圖3。

圖3 TGF-β1誘導后小鼠膽道組織中miRNA-129-5p各個時間點的相對表達水平變化

2.4TGF-β1誘導后各組細胞中EMT標志物表達變化 TGF-β1誘導后膽道上皮細胞FMNL2及Vimentin的蛋白表達水平隨時間增加逐漸增高，24 h的mRNA水平與之前時間點比較，差異有統計學意義(P<0.05)，E-cadherin及CK-19的蛋白表達水平隨誘導時間增加逐漸降低，12 h的mRNA水平與之前時間點比較，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖4、5。

圖4 TGF-β1誘導后各時間點EMT標志物的表達水平

a:P<0.05

圖5 TGF-β1誘導后小鼠膽道組織>EMT標志物的表達水平

2.5過表達miRNA-129-5p后膽道上皮細胞的EMT標志物變化 空白組與陰性干預組在TGF-β1誘導48 h后FMNL2、Vimentin、E-cadherin、CK-19的表達水平差異無統計學意義(P>0.05)，而干預組FMNL2、Vimentin的表達下調(P<0.01)，E-cadherin及CK-19表達水平明顯上調(P<0.05)，見圖6。

圖6 過表達miRNA-129-5p后小鼠膽道EMT標志物48 h免疫熒光圖(×400)

3 討 論

膽道閉鎖是嬰兒期累及肝內外膽管、最終導致終末期肝硬化的嚴重肝臟疾病，其特點為膽管進行性的炎癥、纖維化，并最終消失形成膽道閉鎖。

EMT是指分化成熟的極化上皮細胞喪失上皮/內皮細胞特征，向間充質細胞轉化，使其具有更大的活性和遷移性。EMT很可能參與了膽道閉鎖中多發性硬化性膽管炎的病理機制。

TGF-β1在體內外各種上皮細胞和組織纖維化過程中介導EMT的發生。目前，部分miRNA已被證實在TGF-β1誘導的EMT中發揮關鍵作用，miRNA可能成為新的治療各種慢性病的靶點。有研究發現miRNA-129-5p與EMT的過程密切相關，在心臟、肝臟、肺、皮膚纖維化的過程中，miRNA-129-5p的表達是下調的。

體內外轉染miRNA的前體，如pre-miRNA、pre-mir，以增強相應miRNA的作用，是當前最容易實現的miRNA干擾技術。本課題組通過5 ng/mL的TGF-β1的終濃度干預誘導膽道上皮細胞進一步纖維化，從細胞水平模擬膽道閉鎖的形成。同時進行EMT標志物的檢測，證實了TGF-β1誘導下細胞EMT的形成，miRNA-129-5p的表達隨時間延長逐漸下調。隨后轉染了pre-miRNA-129-5p以上調miRNA-129-5p的表達，并轉染了一段隨機并不會在體內產生任何影響的序列pre-mir作為陰性對照，再給予膽管上皮細胞TGF-β1刺激，檢測轉分化相關指標及細胞外基質成分的變化。結果發現過表達miRNA-129-5p后，膽道上皮細胞標志物E-cadherin、CK-19表達有所上調，而間充質細胞標志物Vimentin、FMNL2表達水平均有所下調，說明上調miRNA-129-5p的表達可以抑制TGF-β1誘導的膽道上皮EMT。這一結果提示miRNA-129-5p可能通過調節TGF-β1通路相關靶基因表達，參與調控膽道上皮細胞轉分化及細胞外基質沉積。在膽道閉鎖EMT進程中起著關鍵的作用。

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