小麥 TaCYP78A5基因的克隆及生物信息學分析

鄭雅月,楊 璐，張炳慧，趙萬春,2，董 劍,2，高 翔,2，李曉燕,2(.西北農林科技大學 農學院，陜西楊凌 7200；2.陜西省小麥工程技術研究中心/陜西省小麥新品種培育工程研究中心，陜西楊凌 7200)

小麥產量由單位面積穗數、穗粒數和千粒質量3因素構成，其中千粒質量在產量構成因素中受遺傳特性的影響最大，廣義遺傳力高達59%～80%[1]。小麥籽粒大小影響千粒質量的形成，屬于受多基因控制的數量性狀[2]。在前人的研究中，利用不同的群體材料，小麥籽粒大小和產量相關的QTL被鑒定出來。例如，Kumar等[3]將控制粒質量的QTL定位在1AS、2BS、7AS上，這些QTL可解釋9.06%～19.85%的表型變異；王瑞霞等[4]在多個環境下將21個與千粒質量相關的 QTL定位在小麥1A、1B、2A、2D、3B、4A、4D、5A、6D和7D染色體上。這些QTL的鑒定與定位，為小麥籽粒大小基因的精細定位與克隆奠定了很好的前期基礎。

目前，對于小麥籽粒大小相關基因的克隆已經取得了一些進展。Song等[5]研究發現，水稻粒寬基因(OsGW2)的同源基因TaGW2通過控制種子發育影響千粒質量。常成等[6]在小麥中克隆了水稻GS3的同源基因PEBP-like基因，發現PEBP-like基因的變異對籽粒的大小以及粒質量產生影響。Wang等[7]克隆了水稻籽粒大小基因OsGS5的同源基因TaGS5，TaGS5-A1與粒寬、粒質量相關，TaGS5-A1b等位基因在種子發育的各個時期其表達量均高于TaGS5-A1a。在水稻中，許多與種子大小相關的基因已經被克隆和功能研究；但在小麥中種子大小相關基因的功能研究還未深入，小麥籽粒大小形成缺乏相應的分子證據。因此，對小麥籽粒大小相關基因進行克隆，并對這些基因如何調控小麥籽粒大小的形成進行解析，是闡釋小麥籽粒大小形成的分子機制的重要前提。

細胞色素P450(Cytochromes P450)是植物中最大的蛋白家族之一[8]。對細胞色素P450的研究發現，CYP78A家族成員具有控制籽粒大小的功能[9-13]。擬南芥中CYP78A5/KLUH基因控制種子的大小，其作用獨立于其他母系因素，通過促進種皮細胞增殖而決定種子大小[9]。擬南芥中CYP78A9基因也是通過控制胚珠和種子發育階段表皮細胞的增殖，進而控制種子表皮的大小，影響種子的大小[13]。在水稻中CYP78A13通過調節胚與胚乳之間的大小平衡來調節種子的大小，CYP78A13基因功能缺失突變體的種子胚增大但胚乳減小，而過表達CYP78A13則會導致種子的胚減小和胚乳增大[12,14]；番茄中CYP78A5/KLUH的同源基因SlKLUH也通過增加細胞數量調控果實大小[15-17]。前人通過遺傳和蛋白結構分析認為CYP78A家族成員之間具有相似功能，然而，小麥中關于CYP78A5的功能研究報道還比較少，CYP78A5基因在小麥中對種子生長發育的調控機理還未被揭示。本研究通過克隆小麥不同籽粒大小材料中CYP78A5基因，分析TaCYP78A5在大粒小麥‘P271’和小粒小麥‘中國春’(‘CS’)序列變異，并進行生物信息學分析，探究其在小麥種子大小形成中的作用，為小麥中細胞色素P450基因調控種子大小提供新的證據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小麥大粒材料‘P271’和小粒材料‘中國春’(‘CS’)均由西北農林科技大學農學院小麥品質遺傳育種實驗室提供(圖1)。將‘中國春’和‘P271’小麥種子用質量分數為3%的次氯酸鈉消毒，然后利用體積分數1%的H2O2溶液催芽處理后在培養箱中培養。2周后，取幼嫩的葉片提取DNA。2016年10月，‘中國春’和‘P271’按常規方法種植在楊凌小麥綜合試驗站實驗田，進行常規播種與田間管理。

1.2 試驗方法

1.2.1 籽粒表型測定 籽粒的粒長、粒寬、千粒質量均由萬深SC-A型種子自動考種儀千粒質量儀測定，表1所示的數據結果是284粒‘中國春’籽粒和285粒‘P271’籽粒經儀器測量和軟件處理所得。

1.2.2 總DNA提取 采用CTAB法[18]提取小麥葉片基因組總DNA。

1.2.3 引物設計和基因克隆 根據NCBI中已公布的基因序列號KT266824.1，采用Primer premier 5.0軟件設計特異性引物TaCYP78A5-F和TaCYP78A5-R，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。以‘中國春’和‘P271’幼苗中提取的DNA為模板，用引物進行PCR擴增，按2×EsTaqMasterMix (CWBIO)說明書配制反應體系25.0 μL，含2×TaqMasterMix 12.5 μL、10 μmol·L-1上下游引物各2.0 μL、DNA 2.0 μL、ddH2O 6.5 μL。擴增程序為 95 ℃ 5 min；95 ℃ 50 s，58 ℃ 50 s，72 ℃ 2 min，30個循環，72 ℃ 10 min。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收目標產物，將目的片段與克隆載體PEASY-T1(TransGen Biotech)連接并轉化入感受態細胞Transl-T1中，篩選陽性單克隆，送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.2.4TaCYP78A5基因生物信息學分析 利用NCBI中BLAST在線軟件(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRA)進行基因序列比對分析，利用NCBI中ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預測序列開放閱讀框，利用DNAMAN 7.0進行基因序列及蛋白質序列比對，在NCBI中CDD(http s:// www. ncbi . nlm.nih.gov/Structure/cdd/docs/cdd_search.html)在線預測氨基酸序列保守結構域，利用ProtParam進行蛋白質一級序列分析(http://web.expasy.org/protparam/)，利用NPS@網站(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsaautomat.pl=/NPSA/npsa_sopma.html)預測蛋白質二級結構，利用SWISS-MODEL軟件(https://swissmodel.expasy.org/ repository)預測蛋白質三級結構。利用pfam預測蛋白質的信號肽(http://pfam.xfam.org/search#tabview=tab1)，利用TMHMM預測蛋白質的跨膜區(http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/)。利用CYP78A5基因全長及其推導的氨基酸序列，在GenBank數據庫查找其同源序列，發現近緣物種中已克隆CYP78A家族的基因序列，通過MEGA 5.0的最大似然法(Maximum Likelihood method)構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 籽粒表型變異

利用自動考種儀千粒質量儀測量‘中國春’和‘P271’種子。經過儀器自帶的軟件處理得出‘中國春’籽粒的平均寬度為2.59 mm，平均長度為5.32 mm，千粒質量為27.68 g，而‘P271’籽粒的平均寬度3.54 mm，平均長度為7.59 mm，千粒質量為57.48 g，‘P271’的籽粒長、寬、千粒質量都明顯高于‘中國春’(表 1)。因此，本試驗將‘中國春’作為小粒材料，‘P271’作為大粒材料研究TaCYP78A5基因與小麥籽粒大小形成的關系。

圖1 小麥‘CS’和‘P271’的籽粒粒型

表1 ‘CS’和‘P271’籽粒的表型數值

2.2 TaCYP78A5基因克隆和序列分析

以特異性引物TaCYP78A5-F:TCTTTCCATGGTTACCGGCC和TaCYP78A5-R:CAG- CTCTCTCTGGCCCTAG擴增得到‘中國春’和‘P271’的TaCYP78A5基因序列各18個，這18條序列聚集成3類，將3類序列提交到小麥資源庫(https://urgi.versailles.inra.fr /blast/blast.php)進行BLAST比對，分別定位到小麥2AS、2BS、2DS染色體上，命名為TaCYP78A5-2A、TaCYP78A5-2B和TaCYP78A5-2D。將TaCYP78A5基因的氨基酸序列在NCBI進行比對，結果顯示TaCYP78A5屬于細胞色素P450家族成員(圖2-A)。利用NCBI中ORF Finder預測序列開放閱讀框，TaCYP78A5與其他CYP78A家族成員一樣均由2個外顯子和1個內含子組成，不同染色體上的TaCYP78A5-2A、TaCYP78A5-2B和TaCYP78A5-2D序列之間顯示出98.17%的高度相似性。TaCYP78A5-2A、TaCYP78A5-2B和TaCYP78A5-2D的編碼區長度分別為1 608、1 638和1 650 bp，編碼534、544、549個氨基酸(圖2-B)。

2.3 TaCYP78A5的蛋白結構預測

利用Protparam網站進行TaCYP78A5蛋白質3個染色體組上序列一級序列理化性質預測如表2，結果顯示蛋白不穩定系數大于40，親水性均為正值，說明TaCYP78A5蛋白可能是不穩定的脂溶性疏水蛋白，且3條染色體上的結果相一致。利用NPS@的SOPMA網站預測TaCYP78A5蛋白序列的二級結構，以TaCYP78A5-2A為例，如圖3-A中的預測結果表明，α-螺旋比例最高，達到49.63%左右；29.96%左右為無規則卷曲；伸展鏈的比例在12.55%，β-轉角最少，約占7.87%。二級結構預測，該蛋白主要以α-螺旋和無規卷曲為主，含少量β-轉角。TaCYP78A5-2B和TaCYP78A5-2D的二級結構組成與TaCYP78A5-2A相似度很高，TaCYP78-A5-2B蛋白的α-螺旋、無規則卷曲、伸展鏈、β-轉角分別各占47.79%、28.86%、14.15%、9.19%。TaCYP78A5-2D蛋白的α-螺旋、無規則卷曲、伸展鏈、β-轉角分別各占45.36%、29.87%、16.76%、8.01%。在SWISS-MODEL網頁提交TaCYP78A5基因的氨基酸序列，在蛋白結構庫中搜索比對模板，得到4i8v.1.A序列與TaCYP78A5氨基酸序列的第48～544個殘基的一致性達28%，且4i8v.1.A序列編碼蛋白也是P450家族蛋白，具備同源建模的條件。從而得到本研究中TaCYP78A5-2A基因所編碼蛋白的三維結構模型如圖3-B，TaCYP78A5-2B和TaCYP78A5-2D蛋白的三級結構組成與TaCYP78A5-2A相似度很高，都是由α-螺旋和兩個反向平行的β-折疊及一對β-轉角組成。將TaCYP78A5編碼的蛋白氨基酸序列輸入TMHMM網址進行蛋白跨膜區結構分析，跨膜區預測結果分析表明該蛋白是膜錨定蛋白，具有跨膜結構域，第 1～8 個氨基酸為膜內區域，第 9～31個氨基酸為跨膜區域，其余的均為膜外區域。Pfam的預測結果(圖3-C)也表明第 1～44 個氨基酸為信號肽區域，其余的為與數據庫比對到的P450家族的序列區域，由此推測TaCYP78A5是一種分泌蛋白。

A.TaCYP78A5基因蛋白家族預測 Proteins prediction ofTaCYP78A5；B.不同植物中CYP78A5氨基酸序列比對，深藍色區域為保守結構域 Alignment of amino acid sequence of CYP78A5 in different plants,the dark blue regions are conserved domain

圖2 小麥CYP78A5蛋白家族預測及推測的氨基酸序列與其他植物的CYP78A5氨基酸序列比對

A.TaCYP78A5-2A蛋白的二級結構，藍色區域為α-螺旋，紫色區域為無規卷曲，紅色區域為伸展鏈，綠色區域為β-轉角 Secondary structure of TaCYP78A5-2A protein,blue area shows alpha helix,purple region as a random coil,the red area is extended strand,the green area is beta turn；B.TaCYP78A5-2A蛋白的三級結構預測 Predicted tertiary structure of TaCYP78A5 protein；C.TaCYP78A5序列匹配和特征 TaCYP78A5 sequence matches and features

圖3TaCYP78A5的蛋白結構預測

Fig.3PredictedstructureofTaCYP78A5protein

2.4 CYP78A基因進化分析

根據TaCYP78A5氨基酸序列與NCBI中的同源序列比對，發現TaCYP78A5序列與水稻及節節麥序列達到85%的一致性(圖2-B)，其中TaCYP78A5-2D與節節麥的CYP78A5-like(GenBank登錄號為XM_020344923)蛋白有很高的一致性(93%)，進一步構建TaCYP78A5和其他已知CYP78A家族成員的系統進化樹(圖4)，水稻CYP78A13(GenBank登錄號為AB780362.1)與水稻CYP78A5(GenBank登錄號為XM_015790749)基因聚于一個分支，顯示出更高的一致性(100%)。且CYP78A家族的其他基因如CYP78A11在不同單子葉物種中的相似性都比較高，可以推測CYP78A家族在單子葉植物中的功能相對保守。而且Xu等[14]研究顯示水稻CYP78A13基因能夠在擬南芥中恢復cyp78a5的缺失表型，這表明CYP78A13和CYP78A5可能是直系同源基因。因此，本研究克隆到的TaCYP78A5基因編碼一個小麥細胞色素P450蛋白，并且可能是擬南芥CYP78A5的直系同源基因。

3 討 論

在CYP450家族中，CYP78A與其他成員不同，它參與植物種子發育等植物特異反應[9,12]。通過對一個新的CYP78A5基因突變體的表型觀察，證明了CYP78A5基因參與多個生長發育調控途徑，包括可能調控植物體的細胞增殖以及發育時期的轉換等，而這些調控途徑又通過CYP78A5這樣的基因形成復雜的調控網絡，從而保證植物的正常生長[19]。CYP78A5基因間接調控赤霉素合成代謝相關基因[20]，且不直接調控植物激素如生長素、細胞分裂素以及油菜素內酯等的代謝[19]。

在模式植物擬南芥和水稻中的研究已經證明CYP78A基因家族多個成員如CYP78A5，CYP78A9和CYP78A13等均具有控制種子大小的功能[9,13-14]。在擬南芥中，Adamski等[9]發現了調控籽粒大小的KLUH/CYP78A5，籽粒中過表達KLU基因，種子的體積和質量都會顯著增加；而當該基因功能缺失時，種子的體積和質量又會顯著降低；KLU基因在花后的胚珠內表皮中表達，通過促進內表皮細胞的增殖，增大表皮細胞的數目，從而達到增大種子表皮的效果，進而增加種子的大小和質量。在水稻中，CYP78A9和其同源基因CYP78A6、CYP78A8，通過促進細胞增殖來調控花器官的生長及種子發育[13,17]。編碼CYP78A13的GE基因在平衡胚和胚乳大小方面有重要的影響，GE基因功能缺失后，胚變大而胚乳變小；相反地，CYP78A13蛋白過表達后，胚變小而胚乳變大，從而導致水稻種子增大[12,14]。而水稻的CYP78A13基因能夠在擬南芥中恢復cyp78a5的缺失表型，這表明CYP78A13和CYP78A5可能是直系同源基因[14]。

圖4 CYP78A家族進化分析

Miyoshi等[21]發現水稻PLA1/CYP78A11基因通過影響頂端分生組織的細胞增殖來調控生殖器官的發育，但在頂端分生組織未檢測到CYP78A11基因的表達，CYP78A11基因可能通過非細胞自制模式控制生殖器官發育。Anastasiou等[22]僅在擬南芥葉、花器官基部檢測到CYP78A5基因的表達，其促生作用卻貫穿整個植株；并提出CYP78A5基因可能依賴于一個可以在細胞間移動的信號，通過非細胞自制模式促進器官生長。相似的，Adamski等[9]發現，PINO:CYP78A5轉基因擬南芥植株中僅在胚珠中過表達CYP78A5基因，卻導致擬南芥花器官的增大、花序的伸長，這一現象也支持CYP78A5基因非細胞自制的作用模式。

本研究克隆的TaCYP78A5與其他CYP78A家族成員一樣均由2個外顯子和1個內含子組成，并與水稻中CYP78A5具有很高的相似性。因此，我們可以推測CYP78A5的同源基因TaCYP78A5在小麥中也可能具有在水稻、擬南芥中類似的功能，通過促進胚珠和種子發育階段表皮細胞增殖來影響種子大小。本研究通過對核酸序列和編碼的氨基酸序列比對分析發現‘P271’和‘中國春’克隆到的TaCYP78A5基因序列一致，說明TaCYP78A5基因在這2個粒型的小麥中相對保守。推測TaCYP78A5基因對這2種粒型的小麥的作用可能是通過在小麥‘P271’的根、莖、葉各組織或籽粒發育過程中基因表達量較高引起的，也可能是TaCYP78A5基因的啟動子在2個材料中的差異所引起。關于TaCYP78A5基因在小麥中的具體的分子作用機制還需進一步證明。

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