熱處理輔助木瓜蛋白酶改善蛋清蛋白的起泡特性

王永梅， 馬曉軍

（江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122）

新鮮的蛋清蛋白因其極高的營養價值和其它食品原料所不可比擬的高起泡性能，被廣泛地應用于蛋糕、面包、餅干、飲料等食品的加工中[1-3]。但因其儲藏周期短、易受污染等缺陷，近年來，在蛋制品行業中開始出現了蛋清粉、全蛋粉等初級蛋制品[4]，然而其起泡特性不佳，限制了在食品工業的應用。因此，為提高蛋制品的起泡特性，人們嘗試采用酶法[5-7]、物理法[8]（如：熱處理、超高壓）及化學法[9]對蛋清蛋白進行改性。目前將物理和酶法相結合改性蛋清蛋白的研究還較少。研究結果表明：利用蛋白酶適度水解蛋白后，其起泡性、溶解性等功能特性均有所改善，制得的蛋糕的體積也有大幅度提高。熱處理和高壓處理也能提高蛋清蛋白的起泡特性，但其影響不顯著[5-7]。

作者采用濕熱預處理蛋清蛋白，可使其中的蛋白酶抑制劑失活，同時蛋清蛋白適度變性，結構松散，有利于酶切位點的暴露；在此基礎上，再利用蛋白酶酶解熱處理后的蛋清蛋白，蛋白酶能優先酶解變性的蛋白質，導致不溶性的蛋白聚集體被降解成可溶性的蛋白，提高了其起泡特性，從而確定最佳的改性工藝條件，制成起泡特性優良的蛋清蛋白粉。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 雞蛋，市售；木瓜蛋白酶（酶活100 000 u/g）：南寧東恒華道生物科技有限公司產品；鄰苯二甲醛（OPA）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、二硫蘇糖醇（DTT）：國藥集團化學試劑有限公司產品。

1.1.2 主要儀器設備 高速攪拌機：上海弗魯克機械有限公司產品；DKZ-450B電熱恒溫振蕩水槽：上海森信實驗儀器有限公司產品；SD-038打蛋器：永康市康爾牛工貿有限公司產品；EL3002電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產品；ARG2型旋轉流變儀：美國TA公司產品。

1.2 測定方法

1.2.1 起泡能力和泡沫穩定性 室溫下，用旋轉攪拌器2 000 r/min轉速條件下攪打稀釋蛋清蛋白液，攪打結束后，立即將泡沫轉移到預先稱重的培養皿（100 mL）中，稱重，記錄100 mL泡沫的質量。倒置，收集120 min后的漏液，稱重[10]。蛋清蛋白液的起泡能力（FC）和泡沫穩定性（FS）的計算公式如下：

其中，Wt1為 100 mL 蛋白液的質量，g；Wt2為 100 mL泡沫的質量，g；Wt3為 120 min后漏液的質量，g。

1.2.2 泡沫的流變學特性 采用平板-平板測量系統，平板橫紋夾具20 mm，間距2.4 mm。靜態剪切流變特性的測定：溫度25℃，測定剪切速率0～0.002865 s-1范圍內泡沫的剪切應力的變化；動態黏彈性流變特性測試參數為：溫度25℃，掃描頻率1 Hz，測定掃描應力0.1～1 000 Pa遞增范圍內儲能模量及損耗模量的變化[11]。

1.3 試驗方法

1.3.1 蛋清蛋白的熱處理 去雜后的蛋清配制成3%的蛋白液， 置于不同溫度下（60、70、80、90、100℃）熱處理不同的時間（5、10、15、20、25、30 min），冷卻至常溫后，均于相同的酶解條件（底物質量分數3%、酶的添加量3 500 u/g、酶解時間2.5 h、酶解溫度55℃、酶解pH 7）下改性，測定蛋清蛋白液的起泡特性。由起泡特性的高低確定蛋清最佳的熱處理溫度和時間。

1.3.2 蛋清蛋白的酶解工藝 蛋清和蛋黃分離，取蛋清于高速分散機下10 000 r/min處理30 s，然后4 500 r/min離心20 min去除雜質[12]。配成一定底物濃度的蛋清蛋白液，攪拌均勻后轉移到反應容器中，90℃預處理10 min[13]，調節pH、溫度至木瓜蛋白酶的最適反應條件。添加木瓜蛋白酶酶解蛋清蛋白，用0.5 mol/L NaOH維持pH恒定，沸水浴滅酶10 min。然后取反應液攪打起泡，測定稀釋蛋清蛋白液的起泡能力和泡沫穩定性。

1.3.3 試驗設計

1）單因素試驗 以蛋白液的起泡能力和泡沫穩定性為試驗指標，對酶的添加量、酶解時間、酶解溫度、酶解pH 5個因素進行單因素試驗，并確定最佳的工藝參數。

2）響應面分析試驗 在單因素實驗的基礎上，根據中心組合設計原理，以起泡能力和泡沫穩定性為響應值，通過響應面分析優化熱處理輔助木瓜蛋白酶改性蛋清蛋白的酶解工藝，獲得最優的酶改性工藝條件。每組實驗重復3次，取其平均值。中心組合實驗的因素水平如表1所示。

表1 中心組合實驗的因素水平表Table 1 Factors and levels of central composite design

2 結果與分析

2.1 蛋清蛋白的熱處理

2.1.1 熱處理溫度對蛋清蛋白起泡特性的影響熱處理導致蛋白質發生變性，分子結構松散呈伸展狀結構，暴露出更多的酶切位點，易被蛋白酶水解。在底物質量分數3%、熱處理時間10 min、酶的添加量3 500 u/g、酶解溫度55℃、酶解時間2.5 h、酶解pH 7的情況下，熱處理溫度與蛋清蛋白的起泡能力和泡沫穩定性的關系如圖1所示。隨著蛋清蛋白熱處理溫度的升高，起泡能力先增大后趨于平緩，泡沫穩定性先增大后緩慢減小。90℃時，蛋清蛋白的起泡能力最大；80℃時，泡沫穩定性最大，此后隨著溫度的增加，泡沫穩定性略有下降。因為蛋清蛋白中含有卵清蛋白和溶解酵素，當溫度達到70℃時，破壞了卵清蛋白的氫鍵、疏水相互作用等次級鍵，蛋白質分子從有序的致密結構轉變為無序的松散伸展狀結構，易于蛋白酶改性[14]；因溶解酵素本身沒有起泡能力，當溫度大于80℃時，起泡能力的持續增大究其原因是溶解酵素二級結構的改變導致的[15]。因此，綜合考慮蛋清蛋白的起泡能力、泡沫穩定性及能耗三方面的因素，熱處理輔助酶解蛋清蛋白的最佳熱處理溫度為90℃。

2.1.2 熱處理時間對蛋清蛋白起泡特性的影響在底物質量分數3%、熱處理溫度90℃、酶的添加量3 500 u/g、酶解溫度55℃、酶解時間2.5 h、酶解pH 7的情況下，熱處理時間與蛋清蛋白的起泡能力和泡沫穩定性的關系如圖2所示。蛋清蛋白的熱處理時間為5～15 min時，起泡能力和泡沫穩定性均呈增加趨勢，隨著熱處理時間的增加，蛋清蛋白中一些組分會逐步發生裂解或伸展，可減少酶解過程中達到同一水解度所需要的時間[14]。當蛋清蛋白熱處理時間為15～30 min時，起泡能力呈急劇下降趨勢，隨著熱處理時間的持續增加，迫使蛋白質分子內部的疏水基團大量暴露，在分子表面的親水基團相對減少，因而蛋白質分子間相互碰撞發生聚合作用，不利于蛋清蛋白的酶解改性；同時，泡沫穩定性的增加，究其原因是蛋清蛋白液粘度的增加影響了泡沫的流變學特性[4]。因此，綜合考慮蛋清蛋白的起泡能力和泡沫穩定性，熱處理輔助酶解蛋清蛋白的最佳熱處理為10 min。

圖1 熱處理溫度對加熱輔助酶解蛋清蛋白起泡特性的影響Fig.1 Effect of heat treatment temperature on foaming properties of egg white protein with heat-assisted enzymatic hydrolysis

2.2 單因素試驗結果與分析

2.2.1 底物質量分數對蛋清蛋白起泡特性的影響在熱處理溫度90℃、熱處理時間10 min、酶的添加量3 500 u/g、酶解溫度50℃、酶解時間 4 h、酶解pH 7的情況下，底物質量分數與蛋清蛋白的起泡能力和泡沫穩定性的關系如圖3所示。由圖3可知，隨著底物濃度的增加，起泡特性呈先增大后減小的趨勢，且在底物濃度較小時，起泡特性增加迅速，在達到最高點之后又緩慢下降。在底物質量分數為3%時，起泡能力和泡沫穩定性均為最大值。這可能是由于底物濃度過低時降低了酶解效率[15]，導致其水解度僅為8.97%；而當底物濃度過高時，蛋清蛋白熱處理變性時導致了其凝固形成凝膠狀，減少了可以與木瓜蛋白酶相結合的有效作用位點，導致不溶性聚集體的增加和可溶性蛋白含量的減小，使得起泡能力顯著下降（P＜0.05）[16]；然而底物濃度對泡沫穩定性的影響卻不顯著（P＞0.05），分析原因是當底物濃度超過4%時，蛋白酶可作用的可溶性蛋白的量有限，導致蛋白的水解度變化不大且均在14%左右，此時聚集在氣液界面的蛋白足以形成較穩固的粘彈性膜來抑制漏液[17]；此外，底物越大，酶解前的熱處理使得溶液的粘度增大，同時酶解后的蛋白的粘度會有部分下降[18]，相互抵消后，其粘度幾乎不變。因此，綜合考慮蛋清蛋白的起泡能力和泡沫穩定性，選取底物質量分數3%為宜。

圖2 熱處理時間對加熱輔助酶解的蛋清蛋白起泡特性的影響Fig.2 Effect of heat treatment time on foaming properties of egg white protein with heat-assisted enzymatic hydrolysis

2.2.2 酶的添加量對蛋清蛋白起泡特性的影響選用適當的加酶量可在確保變性蛋白有限酶解的同時節約生產成本。在底物質量分數3%、熱處理溫度90℃、熱處理時間10 min、酶解溫度50℃、酶解時間4 h、酶解pH 7的情況下，酶的添加量與蛋清蛋白的起泡能力和泡沫穩定性的關系如圖4所示。隨著酶添加量的增大，蛋清蛋白的起泡能力先增大后減小，在酶的添加量為3 500 u/g時，起泡能力為最大值；而泡沫穩定性先緩慢降低，在酶的添加量為5 500 u/g時，降到最低值。輕度水解時，蛋白相對分子質量降解為多肽鏈，并能快速在界面上吸附并展開，降低了表面張力，使得蛋白的起泡能力增大[17]。因酶解時間的過長，蛋白質水解過度，形成了相對分子質量較小的肽鏈，而較短的多肽鏈不利于氣-液界面堅固薄膜的形成，使得起泡能力和泡沫穩定性均急劇下降[8]。同時，酶解導致蛋白液粘度降低，有可能也是泡沫穩定性下降的原因之一。因此，綜合考慮蛋清蛋白的起泡能力、泡沫穩定性和經濟成本3方面的因素，選取酶的添加量3 500 u/g為宜。

圖3 底物質量分數對加熱輔助酶解的蛋清蛋白起泡特性的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on foaming properties of egg white protein with heatassisted enzymatic hydrolysis

圖4 酶的添加量對加熱輔助酶解蛋清蛋白起泡特性的影響Fig.4 Effect of the added amount of enzyme on the foaming properties of egg white protein with heat-assisted enzymatic hydrolysis

2.2.3 酶解溫度對蛋清蛋白起泡特性的影響 在底物質量分數3%、熱處理溫度90℃、熱處理時間10 min、酶的添加量3 500 u/g、酶解時間 4 h、酶解pH 7的情況下，酶解溫度與蛋清蛋白的起泡能力和泡沫穩定性的關系如圖5所示。酶解溫度對蛋清蛋白的起泡特性影響顯著（P＞0.05）。隨著酶解溫度的升高，蛋清蛋白的起泡能力呈先增大后降低的趨勢，泡沫穩定性先增大后降低再增大的趨勢。在酶解溫度50℃時，蛋清蛋白的起泡特性最佳。木瓜蛋白酶水解的最適溫度范圍為50～60℃，在此溫度范圍內，木瓜蛋白酶酶解蛋清蛋白的水解程度最大，但蛋白的起泡特性和水解程度并不成正比，因適當的有限酶水解是起泡特性改善的關鍵所在[4]。65℃時，泡沫穩定性略有增大。研究表明，液體的粘度與蛋白的水解度呈正比。推測原因是，65℃時酶活降低[20]導致水解度降低為14%左右，此時和50℃的水解度相近，所以與60℃相比，此時的液體粘度增大了，從而導致泡沫穩定性的輕微增強[18]。涂勇剛[21]等采用響應面分析優化了木瓜蛋白酶改善蛋清蛋白起泡特性的工藝，研究表明酶解溫度47.5℃時，起泡特性最佳。蛋白酶能優先酶解變性的蛋白質，不溶性聚集體被降解，得到更多的可溶性成分，但溫度過低時，酶與底物的反應速率慢，得到的可溶性成分不足，降低了蛋白質的起泡特性[14]。因此，綜合考慮蛋清蛋白的起泡能力、泡沫穩定性及能耗等因素，選取酶解溫度50℃為宜。

圖5 酶解溫度對加熱輔助酶解蛋清蛋白起泡特性的影響Fig.5 Effect of enzymatic temperature on foaming properties of egg white protein with heatassisted enzymatic hydrolysis

2.2.4 酶解時間對蛋清蛋白起泡特性的影響 在底物質量分數3%、熱處理溫度90℃、熱處理時間10 min、酶的添加量3 500 u/g、酶解溫度50℃、酶解pH 7的情況下，酶解時間與蛋清蛋白的起泡能力和泡沫穩定性的關系如圖6所示。隨著酶解時間的延長，蛋清蛋白的起泡能力也隨之增加，到3.5 h時達到最大值，其后呈下降趨勢；而泡沫穩定性先增大后減小，當酶解時間在0～1.5 h時泡沫穩定性增加顯著（P＜0.05），在3.0 h時達到最大值。在最初的酶解進程中，因熱處理使蛋清蛋白結構伸展，增大了蛋白質分子的柔性，易于蛋白酶酶解[18]，促進了肽鍵的暴露，有利于氣液界面上蛋白分子間的相互作用，從而提高蛋白的起泡特性。之后隨著酶解時間的延長，蛋白酶能夠降解不溶性聚集體得到可溶性蛋白成分，提高了起泡特性但不顯著（P＞0.05）；當酶解時間超過3.5 h后，隨著酶解反應的進行，底物濃度減小，有效酶切位點數量降低，產物濃度增加，其對底物的競爭性抑制變強，水解度變化不大，導致了蛋清蛋白起泡特性的下降[14]。因此，綜合考慮蛋清蛋白的起泡能力、泡沫穩定性及能耗3方面因素，選取酶解時間3.5 h為宜。

2.2.5 酶解pH對蛋清蛋白起泡特性的影響 在底物質量分數3%、熱處理溫度90℃、熱處理時間10min、酶的添加量3 500 u/g、酶解溫度50℃、酶解時間4h、酶解pH 7的情況下，酶解pH與蛋清蛋白的起泡能力和泡沫穩定性的關系如圖7所示。由圖6可知，隨著pH的增加，蛋清蛋白的起泡能力和泡沫穩定性均呈先升高后降低的趨勢。在pH 7時，起泡能力和泡沫穩定性均達到最大值，pH 6.5～7.5之間，泡沫的穩定性相差不大，即體系在中性環境下，起泡特性良好；因木瓜蛋白酶的最適pH范圍為5～7，但當體系過酸或過堿時，會抑制蛋白酶的活力，從而影響蛋白質的水解，導致蛋清蛋白液中的聚集體不能得到有效降解，降低了蛋清蛋白的起泡特性[11]。綜合考慮蛋清蛋白的起泡能力和泡沫穩定性，選取酶解pH 7為宜。

圖6 酶解時間對加熱輔助酶解蛋清蛋白起泡特性的影響Fig.6 Effect of enzymatic time on foaming properties of egg white protein with heat-assisted enzymatic hydrolysis

2.3 響應面試驗結果和方差分析

在單因素實驗結果的基礎上，利用Box-Behnken對影響熱處理輔助酶解蛋清蛋白起泡特性的酶解因素進行響應面分析實驗，并對實驗結果進行統計分析，結果見表2。

圖7 酶解pH對加熱輔助酶解蛋清蛋白起泡特性的影響Fig.7 Effect of pH on foaming properties of egg white protein with heat-assisted enzymatic hydrolysis

表2 中心組合實驗設計及實驗結果Table 2 Experimental design of central composite design and results obtained from the process

2.3.1 不同因素對起泡能力的影響 運用Design Expert V8.0.6軟件對表2中的蛋清蛋白的起泡能力進行回歸方程及變量方程分析見表3。

以蛋清蛋白的起泡能力為響應值，通過Design-Expert 7.1.3統計軟件對實驗結果進行回歸分析，并剔除不顯著項，得到的二階多項式為：起泡能力 （%）=1 485.89-93.36A-86.35B+39.91C-61.94AB+66.57AC-72.25BC-62.67A2+77.22B2+3.12C2。從方差分析表3可以看出，p=0.004 4，說明模型極顯著。決定系數R2=0.915 3，說明該模型的擬合性較好，可用此模型來分析和預測蛋清蛋白的酶解工藝參數。失擬項不顯著，說明方程模擬較好。一次項A、B，二次項A2、B2對蛋清蛋白的起泡能力影響極為顯著，交互作用項AC、BC對蛋清蛋白的起泡能力影響顯著，說明這些因素存在相互作用。通過對各影響因素進行F值檢驗，得到因素之間貢獻作用依次是酶的添加量＞酶解時間＞酶解溫度。由p值可以看出，A、B、AC、BC、A2、B2對起泡能力的影響顯著。

2.3.2 不同因素對泡沫穩定性的影響 運用Design Expert V8.0.6軟件對表2中蛋清蛋白的泡沫穩定性進行回歸方程及變量方程分析見表4。

以蛋清蛋白的泡沫穩定性為響應值，將實驗數據進行回歸分析，并剔除不顯著項，得到的二階多項式為：泡沫穩定性 （%）=76.64-4.37A-3.71B+4.84C-0.16AB+0.47AC-2.66BC+0.61A2+7.59B2-5.53C2。從方差分析4可以看出，酶的添加量對泡沫穩定性影響最大，其次是酶解溫度，酶解時間影響最小。由p值可知，A、C、B2對泡沫穩定性影響顯著。

按兩者權重1∶1，軟件給出的最優酶解工藝條件為：底物質量分數3%、酶的添加量3 500 u/g，酶解時間2.5 h，酶解溫度55℃、酶解pH 7。預測的蛋清蛋白的起泡能力為1 750.30%，泡沫穩定性為93.17%。經實驗驗證，該蛋清蛋白的起泡能力為1741.38%，泡沫穩定性為93.38%。與空白對照組（起泡能力為770.69%，泡沫穩定性為47.25%）相比，起泡能力提高了125.95%，泡沫穩定性提高了97.63%。Hammershoj[9]等人用中性蛋白酶改性卵清蛋白后，水解度在15%～40%之間時能獲得最佳起泡特性，其起泡能力和泡沫穩定性分別提高了20.45%、16.67%，然而起泡特性的改善效果卻不佳，可能是水解度太大導致的。作者的改性蛋白的水解度在13%左右，起泡特性卻有大幅度的提高。與徐東紅[8]用40 000 U/g的復合酶酶解改性的蛋清蛋白相比，起泡能力要高于其結果，而泡沫穩定性相對略低。出現這種結果的原因可能是起泡特性測定方法的不同造成的差異，或是濕熱處理的蛋清蛋白經酶解后仍然存在少量的蛋白聚集體，對在氣液界面上更快的形成更加穩固的粘彈性界面膜有消極作用。從實驗結果可以看出，熱處理輔助木瓜蛋白酶酶解后的蛋清蛋白的起泡特性得到了提高，更重要的是其起泡能力得到了大幅度的提高，這對其進一步應用是有利的。

表4 泡沫穩定性回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance for regression model of foaming stability

2.4 泡沫的流變學特性的測定

泡沫的靜態流變測試是通過掃描時間得到相應的剪切應力的變化趨勢，可以此來評估泡沫屈服應力的變化情況。對照組和改性蛋白泡沫的靜態流變特性結果如圖8所示。改性蛋白和對照組泡沫的最大剪應力分別是141.2，113.4，因屈服應力和剪應力呈正比，所以改性蛋白泡沫的最大屈服應力是對照組的1.2倍，能夠承受的屈服應力越高，相應的，泡沫越穩定。與測定的泡沫穩定性結果相一致。

泡沫的動態流變測試是在固定振動頻率的條件下，系統地變化應力而得到的泡沫儲能模量（G′）與損耗模量（G″）的變化情況，可以此來反應泡沫的穩定程度和泡沫開始破裂時承受的應力大小。泡沫的動態流變特性結果如圖9所示。由圖9可知，兩組蛋白泡沫的G′均大于G″，表現為固態樣品。改性蛋白和對照組蛋白的泡沫開始出現破裂的應力分別為31.62，15.85，改性后的蛋白的泡沫能夠承受的屈服應力是對照組的2倍，關于在直線區域的泡沫的平均G′，改性蛋白和對照蛋白分別為1372.8，982.4，改性蛋白泡沫的儲能模量G′更大，同時兩組蛋白泡沫的損耗模量G″相比，對照組略大些，所以改性后的蛋白泡沫更加穩定，原因是改性后的蛋白質肽鏈打開，疏水鍵更多的暴露出來，使得表面疏水性增大，而高的表面疏水性可以使得粘度升高分散性變好，從而可提高起泡特性。

圖8 泡沫的穩態流變特性曲線Fig.8 Steady state flow curves on foams

圖9 泡沫的動態流變特性曲線Fig.9 Oscillatory stress sweep curves on foams

3 結語

研究分析了熱處理溫度和時間對熱處理輔助木瓜蛋白酶改性的蛋清蛋白起泡特性的影響，得出最佳熱處理條件：熱處理溫度90℃，熱處理時間15 min。通過單因素和響應面優化得出熱處理輔助木瓜蛋白酶改性蛋清蛋白的最佳酶解工藝條件為：底物質量分數3%、酶的添加量3 500 u/g、酶解時間2.5 h、酶解溫度55℃、酶解pH 7。在此條件下，與未改性的稀釋蛋清蛋白相比，起泡能力提高了112.97%，泡沫穩定性提高了93.27%。同時，泡沫流變學特性結果和蛋清蛋白起泡特性相一致。熱處理輔助木瓜蛋白酶改性蛋清蛋白的起泡特性有了大幅度提高，為蛋清蛋白粉在蛋糕預混合粉中的應用提供了依據。

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