D-阿洛酮糖對(duì)Wistar大鼠脂質(zhì)代謝作用的研究

黃維來(lái)， 江 波， 張 濤

（食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫 214122）

肥胖是一個(gè)世界性的問(wèn)題，它會(huì)增加冠心病、糖尿病和癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[1-4]。飲食和肥胖之間的聯(lián)系非常緊密，有報(bào)道稱約50%的高果糖漿以及果糖會(huì)轉(zhuǎn)換成脂肪[5-6]，同時(shí)也有報(bào)告顯示果糖還會(huì)引起高血脂，胰島素抵抗力下降和Ⅱ型糖尿病[7]。D-阿洛酮糖（D-ribo-2-hexulose），是 D-果糖在 C-3位置差相異構(gòu)形成的一種稀有糖（圖1），它天然存在于蔬菜和水果中，但其含量很低，甜度是蔗糖甜度的70%[8]。D-阿洛酮糖食用后不易被人體代謝，幾乎不產(chǎn)生能量，而且具有良好的食品加工特性，它作為一種新型的功能性甜味劑配料，在食品開(kāi)發(fā)中可以替代傳統(tǒng)甜味劑，成為功能性食品添加劑研究領(lǐng)域的一項(xiàng)熱門(mén)內(nèi)容[9-10］。同時(shí)D-阿洛酮糖商業(yè)化生產(chǎn)的實(shí)現(xiàn)，使得對(duì)于D-阿洛酮糖進(jìn)行的體內(nèi)研究變得可行[11]，目前作者所在實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)能夠利用食品級(jí)微生物枯草桿菌實(shí)現(xiàn)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的表達(dá)，為酶法生產(chǎn)D-阿洛酮糖奠定了基礎(chǔ)[12]。作者用D-阿洛酮糖取代傳統(tǒng)膳食的糖類，研究D-阿洛酮糖對(duì)大鼠肥胖以及脂質(zhì)代謝的影響。

圖1 D-果糖和D-阿洛酮糖的分子式Fig.1 Molecular structures of D-Fructose and D-Psicose

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

D-阿洛酮糖：實(shí)驗(yàn)室自制備；動(dòng)物總RNA快速提取試劑盒，基因引物設(shè)計(jì)和合成：上海捷瑞生物工程有限公司產(chǎn)品；RT-PCR試劑盒，SYBR熒光染料：TaKaRa生物有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為分析純?cè)噭?/p>

Nikon Ti倒置顯微鏡：日本Nikon公司產(chǎn)品；BIO-RAD680酶標(biāo)儀：美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；微量分光光度計(jì)Spectrophotometer：北京凱奧科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；CFX96熒光定量PCR儀：美國(guó)BIORAD公司產(chǎn)品；Centrifuge 5427R冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；V-1200型可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海翱藝儀器有限公司產(chǎn)品；Forma 900系列超低溫冰箱：美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；Modell RM2235組織切片機(jī)：德國(guó)Leica公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)Wistar大鼠 （3周齡，雄性），購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005，飼養(yǎng)于清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（江南大學(xué)），溫度（23±2 ℃），濕度 60%，自由飲水和采食。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和干預(yù)處理都依照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和樣品準(zhǔn)備 25只雄性Wistar大鼠用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為5組（n=5），分別為基礎(chǔ)對(duì)照組（AIN-76A）、葡萄糖組（AIN-Glu）、果糖組（AIN+Fru）、阿洛酮糖組（AIN+Psi）以及纖維素組（AIN+Cel）。適應(yīng)一周后開(kāi)始按飼料配方喂養(yǎng)。基礎(chǔ)對(duì)照組飼料配方參照美國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)推薦的AIN-76A實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料配方配制而成[13]，其他組在此基礎(chǔ)上將其中的淀粉換成等量的葡萄糖、果糖、D-阿洛酮糖以及纖維素。

1.2.3 大鼠血液的采集與組織保存 飼喂?jié)M4周后，大鼠禁食12 h后，稱重后，刺破心臟處死。從心臟中取血液進(jìn)行相應(yīng)生理生化指標(biāo)檢測(cè)。大鼠處死后，迅速打開(kāi)腹腔，取出肝臟等主要器官，用生理鹽水清洗后稱重。另外取一部分肝小葉，用體積分?jǐn)?shù)4%的中性甲醛溶液固定，再剪下一部分肝小葉置于RNA保存液中保存，剩余的用液氮速凍后快速轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱中保存以備下次使用。

1.2.4 血清和組織生化指標(biāo)的測(cè)定 得到的全血通過(guò)室溫靜置 3 h，3 000 r/min，4℃離心10 min分離制備血清，血清中的總膽固醇 （TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C），游離脂肪酸采用血液生化指標(biāo)的試劑盒進(jìn)行酶法測(cè)定，批號(hào)為20090228。

1.2.5 肝組織病理學(xué)切片 將適量的新鮮肝組織放入體積分?jǐn)?shù)4%中性甲醛溶液固定，經(jīng)脫水→浸蠟→包埋→切片→脫蠟→蘇木素染色→沖洗→伊紅復(fù)染→梯度脫水→封片等步驟，制作組織切片。于光學(xué)顯微鏡下觀察肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)及病理改變。

1.2.6 分析基因表達(dá)的實(shí)時(shí)定量PCR 提取大鼠肝臟中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以GADPH作為內(nèi)參基因，檢測(cè)各個(gè)模板的Ct值，進(jìn)行相對(duì)定量。大鼠肝組織中總RNA提取使用RNA提取試劑盒，以A260nm/A280nm光吸收比值鑒定RNA純度。總RNA（1 μg）通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。實(shí)時(shí)PCR使用CFX96熒光定量PCR儀，PCR反應(yīng)混合物制備使用的是由12.5 μL的熒光染料SYBR，1 μL 的前引物，1 μL 的后引物，2 μL 的 DNA 模板和8.5 μL的滅菌蒸餾水組成的25 μL的體系。目標(biāo)基因的表達(dá)水平均是相對(duì)于對(duì)照組基因的改變倍數(shù)，表1為所用到的引物序列。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理方法

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）的形式表示。采用ANOVE方法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較和差異顯著性檢驗(yàn)，組間比較采用Turkey檢驗(yàn)，以p＜0.05認(rèn)為存在顯著差異性。

表1 實(shí)時(shí)定量RT-PCR使用的引物序列Table 1 Sequences of primers used in quantitative realtime reverse transcription PCR

2 結(jié)果與討論

2.1 D-阿洛酮糖對(duì)Wistar大鼠生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

分組時(shí)各組實(shí)驗(yàn)大鼠體質(zhì)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠體質(zhì)量平穩(wěn)增長(zhǎng)，生長(zhǎng)發(fā)育良好，同時(shí)AIN+Psi組的體質(zhì)量變化最為緩慢，見(jiàn)圖2。8周齡時(shí)，AIN+Psi組體質(zhì)量明顯低于其它3組 （P＜0.05），且AIN+Psi組的體質(zhì)量增長(zhǎng)量明顯小于其他組（P＜0.05）。AIN+Cel組的大鼠體質(zhì)量增加量?jī)H次于AIN-76A組，可能存在的原因是纖維素增強(qiáng)了大鼠腸道對(duì)于食物的消化吸收，使得大鼠每日的飼料攝入量增加，能量攝入也隨之增加，從而導(dǎo)致大鼠體質(zhì)量上升。機(jī)體內(nèi)的白色脂肪可以將機(jī)體內(nèi)過(guò)剩的能量以脂肪的形式儲(chǔ)存起來(lái)，這部分脂肪主要包括睪周脂，腹周脂以及腸周脂[15]。AIN+Psi組大鼠的睪周脂及腹周脂顯著下降（p＜0.05），而其他組都沒(méi)有顯著性變化。說(shuō)明D-阿洛酮糖具有降低機(jī)體脂肪和減重的作用。

圖2 實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠體質(zhì)量變化Fig.2 Body weight during the experiment

2.2 D-阿洛酮糖對(duì)大鼠血脂水平的影響

在實(shí)驗(yàn)剛開(kāi)始的時(shí)候，各組大鼠的TC、TG指標(biāo)無(wú)顯著差異，喂養(yǎng)4周后，可以看出AIN+Psi組大鼠的TG顯著低于其他組 （p＜0.05）。其中AIN+Glu，AIN+Fru以及AIN+Cel組的TG指標(biāo)無(wú)顯著差異性，但都低于AIN+76A組。TC整體沒(méi)有顯示出明顯的差異。

游離脂肪酸（FFA）是中性脂肪分解成的物質(zhì)，當(dāng)肌肉活動(dòng)所需能源肝糖耗盡時(shí)，脂肪組織分解中性脂肪酸成為FFA來(lái)充當(dāng)能源使用，血清中的FFA的濃度與脂肪代謝、糖代謝、內(nèi)分泌有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FA與其他血脂指標(biāo)相比較，能更早、更靈敏的反映機(jī)體血脂代謝紊亂的情況，另外它也受很多因素影響，肥胖、攝食過(guò)多，β受體異常及交感神經(jīng)興奮等都可使FFA濃度升高[16-17]。由表2可知AIN+Glu、AIN+Fru以及AIN+Psi的 FFA濃度顯著低于其他兩組（P＜0.05），其中AIN+Psi組是其中最小的。

低密度脂蛋白（LDL-C）是一種運(yùn)載膽固醇進(jìn)入外周組織細(xì)胞的脂蛋白顆粒，可被氧化成氧化低密度脂蛋白，當(dāng)?shù)兔芏戎鞍祝绕涫茄趸兔芏戎鞍祝∣X-LDL）過(guò)量時(shí)，它攜帶的膽固醇便積存在動(dòng)脈壁上，累計(jì)到一定的量容易引起動(dòng)脈硬化。低密度脂蛋白被認(rèn)為是致動(dòng)脈粥樣硬化的主要因素以及進(jìn)行調(diào)脂治療的第一指標(biāo)[18]。由表2所示，與AIN-76A相比，其他4組LDL-C水平均顯著下降（p＜0.05）， 其中 AIN+Psi組和 AIN+Cel組沒(méi)有顯著性差異，但是呈現(xiàn)一個(gè)最小的LDL-C值，可以看出，D-阿洛酮糖和纖維素具有一定的抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。

2.3 D-阿洛酮糖對(duì)大鼠肝臟組織形態(tài)的影響

解剖后發(fā)現(xiàn)AIN+Glu組和AIN+Fru組大鼠肝臟腫大，且伴有不同程度的色澤變淺，顏色由正常的暗紅褐色轉(zhuǎn)變?yōu)樯铧S褐色，質(zhì)地較為粗糙，有顆粒感，同時(shí)其他組大鼠肝臟色澤深紅，有一定光澤，細(xì)膩無(wú)顆粒感。Wistar大鼠肝臟組織病理學(xué)變化如圖 3所示。由圖可見(jiàn)AIN+Psi和AIN+Cel組大鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝板排列整齊，肝細(xì)胞未見(jiàn)明顯異常變化。而AIN+Glu和AIN+Fru組大鼠肝臟細(xì)胞腫大，細(xì)胞間界線含糊，內(nèi)部含有數(shù)量不等的脂肪空泡，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。同時(shí)AIN-76A組較以上兩組有所改善，但脂肪積累仍高于AIN+Psi和AIN+Cel組，說(shuō)明D-阿洛酮糖可以減少大鼠肝臟脂肪積累。

2.4 肥胖相關(guān)性的基因表達(dá)的變化

如圖4所示，AIN+Psi組大鼠PPAR-α基因的表達(dá)顯著上升 （P＜0.05），F(xiàn)AS基因的表達(dá)顯著下降（P＜0.05）， 與 AIN-76A 組相比，AIN+Glu，AIN+Fru以及AIN+Cel組PPAR-α基因的表達(dá)無(wú)顯著變化，但FAS基因的表達(dá)均顯著上升（P＜0.05）。

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated receptors，PPARs），主要功能是參與肝臟脂肪代謝和脂肪細(xì)胞的分化，其中PPAR-α是PPARs的一種亞型，其高表達(dá)于肝臟中[19]。PPAR-α的作用機(jī)理是它通過(guò)與配體結(jié)合從而被激活，激活后的PPAR-α與9-順式視黃醛受體α（RXRα）形成異二聚體，從而與靶基因啟動(dòng)子上的過(guò)氧化物增殖物反應(yīng)原件（PPRE）結(jié)合，最后使該基因活化，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄表達(dá)[20]。其中含有PPRE結(jié)構(gòu)的基因是一些參與脂質(zhì)代謝的酶，包括脂酰基輔酶A氧化酶，過(guò)氧化物體雙功能酶，肝臟脂肪酸結(jié)合蛋白，微粒體cYP4A，細(xì)胞色素P450，脂肪酸-羥化酶，超氧歧化酶，磷脂轉(zhuǎn)移蛋白，解偶聯(lián)蛋白家族成員等[21]。PPAR-α通過(guò)上述途徑參與到脂質(zhì)代謝的過(guò)程中。與其他組相比，AIN+Psi組的大鼠的PPAR-α表達(dá)顯著上升（p＜0.05），可以推測(cè)D-阿洛酮糖可以減少脂肪肝的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)可以起到降血脂的作用。

脂肪酸合成酶（FAS）是脂肪酸合成的限速酶，在體內(nèi)催化單酰輔酶A和丙二酰輔酶A結(jié)合成長(zhǎng)鏈脂肪酸，F(xiàn)AS的活性將直接影響體內(nèi)脂肪酸的合成，從而對(duì)機(jī)體的脂質(zhì)代謝起到重要作用[22]。當(dāng)FAS酶活力升高時(shí)，可是使得動(dòng)物體內(nèi)多余的脂肪酸通過(guò)酯化作用形成脂肪，增加脂肪在動(dòng)物體內(nèi)的沉積。有報(bào)告稱在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠模型中，血清中TG水平升高的同時(shí)，F(xiàn)AS的表達(dá)水平也隨之升高[23]。同時(shí)隨著動(dòng)物組織中FAS的表達(dá)增加，TG在體內(nèi)沉積的速度加快，從而導(dǎo)致肥胖[24]。從圖4可知，添加了D-阿洛酮糖的大鼠組的FAS值最小（p＜0.05），可以推測(cè)D-阿洛酮糖通過(guò)減少FAS基因的表達(dá)，從而控制脂肪酸合成脂肪，起到一個(gè)控制體重的作用。

表2 不同糖對(duì)大鼠TG、TC、FFA以及LDL-C的影響Table 2 Effects of dietary carbohydrates on TG、TC、FFA and LDL-C

圖3 D-阿洛酮糖對(duì)大鼠肝組織的影響（HE染色，400倍放大）Fig.3 Effect of D-psicose on rat（By HE stain×400）

圖4 大鼠肝臟PPAR-α，F(xiàn)AS基因mRNA的表達(dá)Fig.4 mRNA expression of PPAR-α，F(xiàn)AS in the liver of Wistar Rat

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)研究改變?cè)猩攀持械奶妓衔锏姆N類，發(fā)現(xiàn)D-阿洛酮糖具有降低血脂，控制體質(zhì)量的作用。給予大鼠D-阿洛酮糖飲食后，與其他組大鼠相比，D-阿洛酮糖組體質(zhì)量下降，血清中的TG、FFA、LDL-C 含量下降（p＜0.05），但是 TC 變化不明顯。實(shí)時(shí)定量PCR分析顯示與其他組相比，D-阿洛酮糖通過(guò)上調(diào)肝臟中的PPAR-α基因的mRNA表達(dá)水平（p＜0.05），同時(shí)下調(diào)FAS基因的mRNA表達(dá)水平（p＜0.05），抑制肝臟中膽固醇的表達(dá)以及脂肪的合成從而起到降低血脂控制體質(zhì)量的作用。

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