靶向Cyclin D1基因RNA干擾對肝癌細胞增殖和Mdm2等基因表達影響的研究*

張弘英，胡樹根，胡利琳，丁 浩△

(1.南昌大學第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，南昌 330006；2.江西省南昌市新建區(qū)人民醫(yī)院 330100； 3.南昌大學醫(yī)學院，南昌330006)

細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)是調(diào)控細胞周期G1期的關(guān)鍵蛋白之一，已被證明與包括肝癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[1]。Mdm2和Mdm4在許多腫瘤中都存在著過度表達的現(xiàn)象[2]。肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)因其惡性程度較高，預后差，被稱為“癌中之王”[3]，其在我國發(fā)病率和病死率均較高[4]，然而針對HCC的治療方法均不是很理想。本文研究靶向Cyclin D1基因RNA干擾對肝癌細胞增殖和Mdm2、Mdm4、P53和P21基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人肝癌細胞株Hep3B由本研究組保存；培養(yǎng)基MEM和胎牛血清(美國Gibco)；Cyclin D1-siRNA和NC-siRNA(上海吉凱)，Cyclin D1-siRNA序列的抑制效果在本研究組以往實驗中得到了證實；Trizol及脂質(zhì)體LipofectamineTM(美國Invitrogen)；2×Taq PCR MasterMix(北京天根生物)；細胞活力檢測試劑MTT(上海索萊寶生物)；TUNEL凋亡原位檢測試劑盒(上海生工生物工程)；蛋白提取試劑盒(上海碧云天生物)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生生物TaKaRa)；引物(上海吉瑪)；Ⅰ抗Cyclin D1、Mdm2、Mdm4、P53、P21及β-actin(美國Santa Cruz)；Ⅱ抗HRP-Goat anti Mouse IgG(北京中杉金橋)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和siRNA轉(zhuǎn)染 把Hep3B細胞放在含有100 μg/mL的鏈霉素、100 U/mL的青霉素及10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，并置于飽和空氣濕度、溫度37 ℃及5%CO2孵箱里培養(yǎng)。細胞以1×106個/孔的密度平鋪在六孔板內(nèi)。孵育24 h后細胞融合率大約為90%。使用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將Cyclin D1-siRNA和NC-siRNA轉(zhuǎn)染細胞。Cyclin D1-siRNA序列：5′ACAAACAGATCATCCGCAA3′，NC-siRNA序列：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′。siRNA濃度為100 nmol/L，脂質(zhì)體每孔5 μL介導轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后48 h收獲細胞。實驗分為空白對照組、陰性對照siRNA(NC-siRNA)組、Cyclin D1-siRNA組。實驗每組重復6次。

1.2.2RT-PCR檢測Cyclin D1、Mdm2、Mdm4、P53、P21 mRNA的表達 配制PCR反應體系:2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL,上游引物1 μL，下游引物1 μL，cDNA 500 ng，補充三蒸水至終體積25 μL。PCR反應條件：1個循環(huán)預變性，95 ℃ 5 min；36個循環(huán)PCR反應，95 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s,72 ℃ 60 s；延伸 72 ℃ 8 min。每個基因取同等量的PCR產(chǎn)物置于瓊脂糖凝膠孔中進行電泳，利用暗箱式紫外透射儀(上海精科)觀察電泳結(jié)果并拍照。最終數(shù)據(jù)以目的條帶/β-actin的灰度值表示，結(jié)果用BANDLEAD 3.00軟件分析。基因引物序列及產(chǎn)物大小見表1。

1.2.3Western blot檢測Cyclin D1、Mdm2、Mdm4、P53和P21蛋白的表達 提取總蛋白使用放射免疫沉淀試驗法，檢測蛋白質(zhì)濃度使用二喹啉甲酸法。提取20 μg蛋白質(zhì)進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上,然后用5 g/100 mL脫脂奶粉液于4 ℃封閉過夜。NC膜用相應的Ⅰ抗(1∶200比例稀釋) 于4 ℃孵育過夜，繼以Ⅱ抗孵育2 h，最終用DAB顯色照相。結(jié)果以目的條帶/β-actin的灰度值表示，用軟件Quantity One分析。

表1 各基因引物序列和產(chǎn)物大小

1.2.4流式細胞儀檢測細胞周期 獲得上述各組細胞，使用流式細胞儀(美國Beckman公司)分析得出細胞各周期的百分率。

1.2.5MTT檢測細胞活力 細胞平鋪于96孔板內(nèi)，其中空白調(diào)零孔只加不含細胞的培養(yǎng)基MEM。對細胞進行處理后，每孔細胞加入5 mg/mL MTT液20 μL，接著孵育4 h，棄上清液后加入150 μL 的二甲基亞砜，劇烈混勻10 min，上酶標儀(上海Bio-Rad)于492 nm處檢測各孔吸光度(A)值。

1.2.6TUNEL檢測細胞凋亡 用PBS洗細胞3次×5 min。加入4%多聚甲醛溶液室溫固定30 min，PBS洗3次×5 min。加入0.1% Triton X-100溶液室溫破膜10 min，PBS洗3次×5 min。實驗組每片以5 μL末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT)及45 μL熒光素標記的dUTP液混勻。玻片干后，加50 μL TUNEL反應混合液于標本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中37 ℃反應60 min。PBS洗3次×5 min。玻片干后加50 μL converter-POD于標本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中37℃反應30 min。PBS洗3次×5min。在組織處加適量DAB底物，顯微鏡下控制顯色。PBS終止顯色。蘇木素復染，中性樹膠封片。觀察，拍照。每張切片于200倍鏡下隨機選擇4個視野，計算陽性細胞數(shù)為凋亡指數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1各組Cyclin D1、Mdm2、Mdm4、P53、P21 mRNA的表達 與空白對照組和NC-siRNA組相比，Cyclin D1-siRNA組P53和P21 mRNA的表達上調(diào)(P<0.05)，Cyclin D1、Mdm2和Mdm4 mRNA的表達下調(diào)(P<0.01)；而空白對照組與NC-siRNA組之間相比，各基因表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖1。

2.2各組Cyclin D1、Mdm2、Mdm4、P53、P21蛋白的表達 與空白對照組和NC-siRNA組相比，Cyclin D1-siRNA組P53和P21蛋白的表達上調(diào)(P<0.01)，Cyclin D1、Mdm2和Mdm4蛋白的表達下調(diào)(P<0.01)；而空白對照組與NC-siRNA組之間相比，各蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2。

表2 流式細胞儀檢測細胞周期

*：P>0.05，與空白對照組和NC-siRNA組比較

2.3各組細胞周期 與空白對照組和NC-siRNA組相比，Cyclin D1-siRNA組細胞G1、S及G2期均無明顯差異(P>0.05)；空白對照組與NC-siRNA組之間比較，各期差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2、圖3。

A：空白對照組；B：NC-siRNA組；C：Cyclin D1-siRNA組；*：P<0.05，與空白對照組和NC-siRNA組比較

圖1各組Cyclin D1、Mdm2、Mdm4、P53、P21 mRNA的表達

A：空白對照組；B：NC-siRNA組；C：Cyclin D1-siRNA組；*：P<0.01，與空白對照組和NC-siRNA組比較

圖2各組Cyclin D1、Mdm2、Mdm4、P53、P21蛋白的表達

A：空白對照組；B：NC-siRNA組；C：Cyclin D1-siRNA組

圖3各組細胞周期情況

2.4各組細胞增殖活力 與空白對照組和NC-siRNA組相比，Cyclin D1-siRNA組細胞增殖活力明顯減弱(P<0.01)；空白對照組與NC-siRNA組細胞增殖活力差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖4。

A：空白對照組；B： NC-siRNA組；C：Cyclin D1-siRNA組；*:P<0.01，與空白對照組和NC-siRNA組比較

圖4各組細胞增殖活力

2.5各組細胞凋亡情況 與空白對照組和NC-siRNA組相比，Cyclin D1-siRNA組細胞凋亡明顯增強(P<0.01)；而空白對照組與NC-siRNA組的細胞凋亡差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖5。

A：空白對照組(×200)；B：NC-siRNA組(×200)；C：Cyclin D1-siRNA組(×200)；*：P<0.01，與空白對照組和NC-siRNA組比較

圖5各組細胞凋亡情況

3 討 論

細胞周期是確保細胞進行生命活動的基本過程，其準確調(diào)控對于生命正常生存、繁殖、發(fā)育及遺傳起到了關(guān)鍵性作用。細胞周期的關(guān)鍵點是G1期的啟動，而Cyclin D1是調(diào)控細胞周期 G1期的關(guān)鍵性蛋白[5]。Cyclin D1在腫瘤細胞中表現(xiàn)為表達過度，造成了G1期的縮短，過度的細胞增殖[6]。Cyclin D1已經(jīng)被證實了與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[7]。肝癌的發(fā)生也與G/S期檢測點的缺陷相關(guān)[8]。Cyclin D1表達下調(diào)可導致肝癌細胞株Huh7細胞的凋亡，使其停滯在G1期[9]。

HCC是全世界最普遍的腫瘤之一，而我國由于乙型肝炎的高發(fā)使肝癌患者占全世界的大部分[10]。目前，針對HCC的治療方法均不理想，療效有限。而基因治療因其可從根本上治愈疾病，故而會是治療HCC的新選擇及新趨勢。

本研究結(jié)果顯示，Cyclin D1基因表達下調(diào)能抑制Mdm2和Mdm4的表達，并能上調(diào)P53和P21的表達；Cyclin D1基因表達下調(diào)能減弱肝癌細胞的增殖，并能誘導其凋亡。Cyclin D1表達下調(diào)對肝癌的細胞周期沒有影響。其可能的原因是，Cyclin D1表達下調(diào)只通過細胞凋亡途徑起作用，而對細胞周期通路并不產(chǎn)生影響。

Mdm2和Mdm4參與了多條細胞調(diào)控通路，并影響了腫瘤發(fā)生與發(fā)展的過程[11]。目前已有的研究表明，很多腫瘤中均有Mdm2和Mdm4表達過度的現(xiàn)象。Mdm2和Mdm4在腫瘤細胞中的過表達，導致了野生型P53的抑癌活性受抑，誘導了腫瘤形成[12]。本研究組既往的研究亦表明[13]，利用RNA干擾技術(shù)使得Mdm2表達沉默減弱了肝癌細胞增殖，并導致其凋亡；下調(diào)Mdm2的表達能上調(diào)抑癌基因P21的表達，而P21是P53途徑最重要的下游基因之一。本研究發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1基因表達下調(diào)能抑制Mdm2和Mdm4的表達，并能上調(diào)抑癌基因P53和P21的表達。這些均表明，Cyclin D1基因表達下調(diào)能抑制肝癌的發(fā)生和生長。沉默Cyclin D1基因的表達能造成肝癌細胞的活力下降，凋亡被誘導。這與預期實驗結(jié)果一致，即Cyclin D1基因表達下調(diào)能抑制肝癌細胞的增殖并促進其凋亡。

綜上所述，Cyclin D1基因表達下調(diào)能抑制Mdm2和Mdm4的表達，并能上調(diào)抑癌基因P53和P21的表達；Cyclin D1基因表達下調(diào)能抑制肝癌細胞的增殖并促進其凋亡。這為肝癌的基因治療提供可能的分子作用靶點。

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