溫度和氯離子對初榨胡麻油中 3-MCPD酯生成的影響

王永瑞 王 丹 徐宇麗 魏長慶

(石河子大學(xué)食品學(xué)院1，石河子 832000) (新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實驗室2，石河子 832000) (石河子出入境檢驗檢疫局3，石河子 832000)

胡麻油，又稱亞麻籽油。是以亞麻科、亞麻屬作物種子胡麻籽為原料生產(chǎn)出的一種營養(yǎng)價值極高的食用油[1]。胡麻適合生長于干旱半干旱地區(qū)，在中國的種植主要是分布在新疆、甘肅、寧夏等西北偏遠(yuǎn)地區(qū)。胡麻油雖然有工業(yè)化生產(chǎn)，但在大部分農(nóng)村地區(qū)依舊是小作坊壓榨自然沉淀，未經(jīng)過精煉直接用于日常飲食中。3-MCPD酯是4類氯丙醇酯中的一類，最早于1980年由Velí?ek等[2]在用酸水解蔬菜蛋白過程中發(fā)現(xiàn)，是一種潛在的致癌物質(zhì)。隨著檢測設(shè)備以及檢測方法的發(fā)展，陸續(xù)有研究者在各類食品中檢測出3-MCPD酯的存在，如餅干、面包皮、咖啡、薯條、魚油、食用油、奶粉等[3-9]。目前報道的采用GC-MS間接法測定3-MCPD酯的相關(guān)研究主要是采用電子轟擊(EI)離子源，采用化學(xué)離子(CI)源的研究相對較少。CI源是軟電離離子源，根據(jù)極性不同分為負(fù)化學(xué)離子源(NCI)和正化學(xué)離子源(PCI)，其中NCI對于柱流失和絕大多數(shù)基質(zhì)成分沒有響應(yīng)，并且對含電負(fù)性元素或基團(tuán)的化合物具有很好的響應(yīng)。3-MCPD的七氟丁酰咪唑(HFBI)的衍生物具有氯原子以及多個氟原子，因而采用NCI源分析3-MCPD七氟丁酰咪唑衍生物會有很好的靈敏度和選擇性[10-13]。本研究采用甲醇鈉-甲醇堿水解，將胡麻油中3-MCPD酯水解釋放出3-MCPD。再用固相萃取柱凈化，結(jié)合同位素稀釋-氣相色譜-負(fù)化學(xué)離子源-質(zhì)譜方法對初榨胡麻油樣品進(jìn)行檢測分析，研究溫度以及氯離子對初榨胡麻油中3-MCPD酯生成的影響，評估初榨胡麻油中3-MCPD酯的風(fēng)險以及為胡麻油精煉工藝改進(jìn)提供參考，更好的把控精煉胡麻油中3-MCPD酯的含量。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

胡麻籽：市售；甲醇鈉、無水硫酸鈉、冰醋酸：分析純；無水硫酸鈉使用前于 650 ℃灼燒 4 h 以上；甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、甲醇、正己烷：色譜純；3-MCPD 棕 櫚 酸 二 酯 ( 98%)，d5-3-MCPD 棕櫚酸二酯(化學(xué)純度： 97%，異構(gòu)體純度： 98.2%)，3-MCPD( 98%)，d5-3-MCPD(化學(xué)純度： 97.5%， 異構(gòu)體純度： 98.7%)。

1.2 實驗儀器

7890A/5975C inert XL EI/CI氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用儀(配有 NCI 源)；OP-Y5歐意普瑞家用榨油機(jī)；XW-80A 旋渦混合儀；Xcelvap 全自動氮吹濃縮儀；FD115 電熱鼓風(fēng)干燥箱；LXJ-IIB低速大容量多管離心機(jī)；ELF 11/14 馬弗爐；Milli-Q 去離子水發(fā)生器； CleanertMCPD 氯丙醇專用固相萃取柱(4 g/30 mL)。

1.3 胡麻油中3-MCPD酯的檢測方法

1.3.1 水解與凈化

準(zhǔn)確稱取 0.10 g 胡麻油樣品至具蓋玻璃試管中，加入 51 μL 10 mg/L 的 d5-3-MCPD 棕櫚酸二酯內(nèi)標(biāo)溶液(相當(dāng)于100 ng 游離態(tài)的 d5-3-MCPD)，加入 0.5 mL 甲基叔丁基醚-乙酸乙酯混合溶液(8∶2)，渦旋混勻后再加入 1 mL 0.5 mol/L 的甲醇鈉/甲醇溶液，渦旋后，靜置反應(yīng)4 min后，迅速加入3 mL冰醋酸-20% 硫酸鈉溶液(1∶30，中和過量的甲醇鈉)和3 mL 正己烷(脫脂)，渦旋混勻，靜置分層后棄去上層有機(jī)相，再加3 mL正己烷重復(fù)脫脂兩次。將下層水相溶液上樣于 CleanertMCPD 氯丙醇專用固相萃取柱中，待液體完全進(jìn)入硅藻土填料后，靜置平衡10 min。再用15 mL 乙酸乙酯在重力作用下洗脫目標(biāo)組分， 將洗脫液接收于裝有 5 g 無水硫酸鈉的玻璃離心管中，然后將洗脫液轉(zhuǎn)移至具蓋試管中，于40 ℃水浴下氮吹濃縮至近干，用 2 mL 正己烷溶解殘渣。

1.3.2 衍生化

向“1.3.1”所得溶液中加入50 μL HFBI，旋緊蓋子并渦旋混勻，置于70 ℃恒溫干燥箱中反應(yīng)25 min。衍生化完成后，取出冷卻至室溫，加3 mL 水并渦旋振蕩30 s后靜置分層，棄去下層水相，重復(fù)水洗3 次后取上層有機(jī)相，經(jīng)無水硫酸鈉除水后裝入進(jìn)樣瓶中，待GC-NCI-MS分析。

1.4 儀器條件

1.4.1 氣相色譜條件

色譜柱： HP-5MS UI石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×250 μm，0.25 μm)； 進(jìn)樣口溫度： 300 ℃； 程序升溫條件：初始溫度為 40 ℃，以 5 ℃/min的速率升溫至 90 ℃，再以 40 /min ℃的速率升溫至 270 ℃，保持 1.5 min； 載氣：高純氦氣(純度≥99.999%)；柱流速：1.0 mL/min； 進(jìn)樣量：1 μL； 進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源： NCI； 反應(yīng)氣：甲烷(純度≥99.99%)；離子源溫度：150 ℃；四級桿溫度：150 ℃；溶劑延遲： 8 min；數(shù)據(jù)采集方式：選擇離子監(jiān)測模式(SIM)。

2 結(jié)果與討論

2.1 3-MCPD和3-MCPD的HFBI衍生物的定性分析

采用間接法檢測分析3-MCPD酯，最終是通過將3-MCPD酯堿水解成3-MCPD后，再經(jīng)過HFBI衍生化進(jìn)行GC-NCI-MS檢測分析。在3-MCPD以及d5-3-MCPD質(zhì)譜圖中，m/z213 [C3F7CO2]-、194[C3F7CO2-F]-、175[C3F7CO2-F-F]-離子碎片的相對豐度較大，但其均為七氟丁酰基的特征離子，并不是3-MCPD或者d5-3-MCPD衍生物的特征離子[11]。本文采用代表性的氯丙醇衍生物的特征離子作為定性、定量離子，如表1所示[12-13]。其中m/z=502以及m/z=507分別為3-MCPD以及d5-3-MCPD七氟丁酰咪唑衍生物的分子離子峰，m/z=482以及m/z=486分別為3-MCPD、d5-3-MCPD七氟丁酰咪唑衍生物的分子離子失去一個HF分子所得到的碎片離子峰，而m/z=446為3-MCPD七氟丁酰咪唑衍生物的分子離子失去一分子HF和一分子HCl所得到的碎片離子峰。

表1 3-氯丙醇及其內(nèi)標(biāo)物衍生產(chǎn)物的特征離子

注：下劃線離子為定量離子，其余為定性離子。

2.2 方法學(xué)評價

2.2.1 線性范圍、檢出限、定量限

準(zhǔn)確移取一定量的3-MCPD以及d5-3-MCPD標(biāo)準(zhǔn)溶液于具蓋試管中，用正己烷定容至2 mL，配制成10、20、40、50、80、100 μg/mL的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中d5-3-MCPD濃度為50 μg/mL。用HFBI衍生后進(jìn)GC-NCI-MS進(jìn)行檢測。圖1為3-MCPD以及d5-3-MPCD標(biāo)準(zhǔn)品衍生物的GC-MS的氣相色譜圖，圖2、圖3分別為3-MCPD以及d5-3-MPCD標(biāo)準(zhǔn)品衍生物的GC-NCI-MS的特征離子質(zhì)譜圖。以3-MCPD以及d5-3-MCPD衍生物的定量離子峰面積之比為縱坐標(biāo)，3-MCPD質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。得到的線性方程為Y=0.568 2X-0.094 3，R2=0.997 4。線性相關(guān)性良好。以信噪比(S/N)為3和10時對應(yīng)的加標(biāo)水平分別作為方法的檢測限和定量限，檢出限為5 μg/kg，定量限為20 μg/kg。滿足油脂中低含量3-MCPD酯的分析檢測。

圖1 3-MCPD,d5-3-MCPD衍生物的氣相色譜圖

圖2 3-MCPD衍生物的質(zhì)譜圖

圖3 d5-3-MCPD衍生物的GC-NCI-MS的質(zhì)譜圖

2.2.2 加標(biāo)回收率

取12份胡麻油初榨油樣品(105 ℃炒籽壓榨并加熱至200 ℃，加熱0.5 h的胡麻油)，其中3份空白對照，其余樣品中分別加入0.25，0.5，1.0 mg/kg 3-MCPD棕櫚酸二酯標(biāo)準(zhǔn)液，每組做3個平行樣，經(jīng)過樣品前處理后檢測3-MCPD酯含量，計算相應(yīng)的加標(biāo)回收率和RSD，如表2所示。結(jié)果表明3-MCPD脂肪酸酯的平均加標(biāo)回收率在80.47%～81.68%之間，RSD 5.60%～8.35%。表明本研究所建立的方法的準(zhǔn)確度和精密度較高，適用于胡麻油中3-MCPD酯含量的測定。

表2 加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.3 初榨胡麻油中3-MCPD酯的消長規(guī)律

2.3.1 低溫炒籽對于初榨胡麻油中3-MCPD酯生成的影響

分別取新鮮胡麻籽1kg 3份，于常溫(25 ℃)、45、65、85、105 ℃烘箱內(nèi)烘烤30 min后用家用榨油機(jī)榨取胡麻油。將榨取物裝于離心管中于-4 ℃，5 000 r/min離心20 min后取出上層油液冷藏保存?zhèn)溆貌⑦M(jìn)行GC-NCI-MS檢測分析。結(jié)果如圖4所示，低溫炒籽對于胡麻油中3-MCPD酯含量的影響不大，且炒籽后壓榨的胡麻油中3-MCPD酯的含量處于一個較低的水平。

圖4 炒籽溫度對于初榨胡麻油中3-MCPD酯含量的影響

2.3.2 溫度對于初榨胡麻油中3-MCPD酯生成的影響

取5支試管，分別加入105 ℃炒籽溫度壓榨的胡麻油8 g，分別置于恒溫二甲基硅油油浴鍋內(nèi)加熱至160、180 、200 ℃，加熱時間為2 h。實驗結(jié)束后取出油樣待冷卻后進(jìn)行分析檢測，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明隨著溫度的升高，胡麻油中3-MCPD酯的含量也在逐漸上升，但上升程度不明顯。這說明對于初榨胡麻油來說，高溫加熱對于3-MCPD酯含量的影響不大。這與Mogol等[5]發(fā)現(xiàn)在餅干烤制程中，3-氯丙醇及其酯的含量隨溫度上升而顯著增大的研究而言有點(diǎn)相悖，原因可能是由于初榨胡麻油未經(jīng)過工業(yè)精煉過程脫膠，脫酸，脫色等以及水洗步驟。脫膠、脫色以及水洗環(huán)節(jié)的酸帶入，氯離子帶入都可能是影響其3-MCPD酯的生成。

圖5 溫度對于初榨胡麻油中3-MCPD酯含量的影響

2.3.3 加熱時間對初榨胡麻油中3-MCPD酯的生成的影響

取5支試管，分別加入105 ℃炒籽溫度壓榨的胡麻油8 g，置于恒溫二甲基硅油油浴鍋內(nèi)加熱至200 ℃，每支試管分別加熱0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h。取出油樣待冷卻后進(jìn)行GC-NCI-MS分析檢測，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明隨著加熱時間的增加，胡麻油中的3-MCPD酯含量呈逐漸上升的趨勢，但對于初榨胡麻油來說，3-MCPD酯的含量上升不明顯，這或許與2.3.3中溫度的影響一致。

圖6 高溫加熱時間對于初榨胡麻油中3-MCPD酯含量的影響

2.3.4 氯離子對于胡麻油中3-MCPD酯生成的影響

取3支試管，分別加入105 ℃炒籽溫度壓榨的胡麻油8 g，第1支試管加入100 μL蒸餾水，第2支試管加入100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的NaCl溶液置于恒溫二甲基硅油油浴鍋內(nèi)加熱至200 ℃，加熱2 h。取出油樣待冷卻后進(jìn)行GC-NCI-MS分析檢測，結(jié)果如圖7所示。結(jié)果表明，隨著加入NaCl的含量的增加，初榨胡麻油中3-MCPD酯的含量呈上升趨勢，且上升的趨勢明顯。這表明氯離子的含量對于初榨胡麻油中3-MCPD酯的生成具有重要影響，這與Freudenstein等[14]的研究成果不謀而合。

圖7 氯離子對于胡麻油中3-MCPD酯含量的影響

含氯化合物是3-MCPD酯的前體物質(zhì)之一，胡麻油工業(yè)精煉需經(jīng)過脫膠，脫酸，脫色，脫臭等步驟。若采用磷酸進(jìn)行脫膠，可能會增加食用油中氯離子的含量，工業(yè)水洗也會導(dǎo)致油中氯離子含量的變化。Craft等[15]以及Matth?us等[16]的研究表明，通過水(不含氯化物)或者乙醇洗滌未精煉的食用油可以部分的除去未精煉的油中的含氯化合物，進(jìn)而有效的限制精煉過程中3-MCPD酯的形成。

3 結(jié)論

3.1 采用甲醇鈉-甲醇堿水解，固相萃取柱凈化，結(jié)合同位素稀釋-氣相色譜-負(fù)化學(xué)離子源-質(zhì)譜方法對胡麻油中3-MCPD酯含量的測定。該方法在0.01～0.10 mg/kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限為5 μg/kg，定量限為20 μg/kg。加標(biāo)回收率在80.47%～81.68%之間，RSD 5.60%～8.35%。表明本研究所建立的方法的準(zhǔn)確度和精密度較高，適用于胡麻油中3-MCPD酯含量的測定。

3.2 炒籽溫度對于初榨胡麻油中3-MCPD酯生成沒有多大影響。低溫炒籽對于初榨胡麻油中3-MCPD酯生成沒有影響。將初榨胡麻油油樣加熱至在160～200 ℃時，初榨胡麻油中3-MCPD酯的生成隨加熱溫度的升高以而增加，但增加不明顯。當(dāng)初榨胡麻油油樣加熱至200 ℃條件下，初榨胡麻油中3-MCPD酯的生成隨加熱時間的增加而增加，但增長不顯著。當(dāng)初榨胡麻油油樣加熱至200 ℃條件下，隨著初榨胡麻油中氯離子含量的增加，初榨胡麻油中3-MCPD酯呈顯著上升趨勢。

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