微乳體系中脂肪酶催化棕櫚酸制備 生物柴油及其工藝優化

朱廣琪 李芳浩 劉 妍 王彩娜 談忠琴 韓曉祥

(浙江工商大學應用化學系，杭州 310018)

生物柴油是一種新型的可再生綠色能源，它具有閃點高、抗爆性好、燃燒性能優良、能有效降低SOx，NOx等有害溫室氣體排放量等優點。生物柴油是一種高級脂肪酸酯類化合物，可以通過動植物油脂、餐飲廢油等為原料與低級醇經過酯交換或酯化反應制備得到。在傳統制備工藝中，常采用濃硫酸作為催化劑。濃硫酸催化時雖有較高催化活性，但存在易發生副反應，產品不易提純，設備腐蝕嚴重，環境污染嚴重等缺點，工藝路線不符合當今社會可持續發展的要求。采用固體酸、金屬鹽類、離子液體等催化劑[1-5]，雖然在一定程度上解決了傳統催化劑存在的一些缺點，但它們仍存在相對活性低、表面易積碳、酸中心分布不均、再生困難等缺陷，從而限制了它們的應用。

微乳體系是指由油、水、表面活性劑和助劑按照一定比例自發形成的熱力學穩定的、外觀透明或半透明的高度分散體系，具有超低的界面張力，穩定的熱力學特性且價格低廉，廣泛用于聚合反應、酶催化反應、分離及納米材料制備等領域[6-13]。脂肪酶作為一種生物催化劑，在催化反應中常具有很高的立體選擇性和區域選擇性，微乳體系中進行脂肪酶催化反應已有文獻報道，微乳體系為脂肪酶提供了適宜的作用環境，從而使脂肪酶顯現出較好的催化性能[14-19]。離子液體，主要由含氮元素的有機陽離子與無機陰離子形成的，在室溫下呈液態的離子化合物。離子液體不僅可以作為催化劑，還能作為綠色溶劑廣泛的應用于多個領域[20]。近年來，通過離子液體構建離子液體微乳液備受關注，離子液體微乳液作為一種新型體系，同時具備了離子液體和微乳液二者的優點，在納米材料的制備，蛋白質萃取分離，醫藥及化工領域已經得到了應用[21-23]。

本試驗以棕櫚酸為模型反應原料，DBSA+TX-100/環己烷/BmimBF4離子液體微乳體系為反應介質，考察了醇酸摩爾比、脂肪酶用量、反應溫度、反應時間等因素對Candidarugosa脂肪酶催化合成棕櫚酸乙酯產率的影響，并采用響應面分析法對該合成反應條件進行優化，以期為生物柴油的綠色制備和高酸值餐飲廢油脂的清潔利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

十二烷基苯磺酸(DBSA)：日本Tokyo Kasei Kogyo有限公司；Candidarugosa脂肪酶：Sigma-Aldrich公司；曲拉通(TX-100)：上海如吉生物科技發展有限公司；1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽(BmimBF4)：阿拉丁試劑公司；環己烷、棕櫚酸、乙醇、氫氧化鈉、酚酞及其他試劑：邁瑞化學試劑公司，皆為分析純。

GC7890B氣相色譜儀，安捷倫公司；GL-3250A磁力攪拌器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DZF-6050真空干燥箱：上海博迅實業有限公司。

1.2 方法

1.2.1 微乳體系的制備

稱取一定質量的DBSA+TX-100與環己烷混合于小燒杯中，在磁力攪拌的作用下，攪拌均勻后向體系中滴加BmimBF4，直至溶液由澄清變渾濁或者由渾濁變澄清，變化臨界點即為相變點。根據三組分中各質量得到溶液的組成分數，整理數據，采用 Origin 8.5 繪制三元相圖。整個實驗過程在30 ℃環境下進行。

根據所繪制的三相圖，在微乳區中任取幾個特殊點，根據各組分的質量分數算出每個組分的質量，配成微乳體系。在相同的反應條件下進行棕櫚酸乙酯的合成。酯化反應結束后，用氣相色譜法檢測棕櫚酸的轉化率，進而確定微乳區的最大反應點，并將此最大反應點作為研究棕櫚酸酯化反應單因素影響的反應點。

1.2.2 微乳體系中棕櫚酸乙酯的合成

在圓底燒瓶中分別加入形成微乳體系的3種組分，磁力攪拌30 min，形成均勻澄清透明的微乳體系。向微乳體系中加入棕櫚酸、乙醇及脂肪酶，在水浴條件下進行酯化反應。酯化產物在Agilent 7890B氣相色譜儀上進行定量分析，FID檢測器，HP-5毛細管柱，月桂酸甲酯為內標物。

2 結果與分析

2.1 離子液體微乳中脂肪酶催化酯化反應

離子液體微乳體系的形成對酯化反應有著重要的影響，實驗研究了DBSA，TX-100等表面活性劑對BmimBF4/環己烷形成微乳液的影響。研究發現單獨DBSA與離子液體不能形成微乳體系，而單獨的TX-100可以與離子液體形成微乳體系，當DBSA與TX-100形成復配表面活性劑同樣可以與BmimBF4及環己烷形成微乳體系。微乳體系三相圖如圖1所示，由圖1可見，表面活性劑對該離子液體微乳液的形成有重要作用，當表面活性劑的比例較小時，通常不能形成微乳液，隨著表面活性劑所用比例的增加，微乳區逐漸擴大，并且也越穩定。

圖1 微乳體系三相圖

在三相圖的微乳區中尋找不同離子液體含量的點，根據不同點三組分的比率，配制離子液體微乳體系，考察離子液體含量對脂肪酶催化合成棕櫚酸乙酯的影響。離子液體含量是影響微乳體系中脂肪酶活性的一個重要因素，離子液體用量對微乳體系中脂肪酶催化酯化反應的影響如圖2所示。由圖2可知，隨著微乳體系中離子液體含量的增加，棕櫚酸乙酯的產率逐漸增長，當體系中離子液體含量達到30%時，棕櫚酸乙酯產率出現了一個峰值。隨后，繼續增加離子液體用量，棕櫚酸乙酯的產率呈現下降的趨勢。一般來說，微乳體系中，酯化反應發生在相界面處，相界面處的面積越大，底物分子間的接觸越充分，從而反應速度加快，提高反應產率。隨著離子液體用量的增加，界面增加，反應過程中生成的水不僅提高酶的活力，也可參與微乳體系的形成，從而進一步促進反應平衡向右移動，棕櫚酸乙酯產率增加。離子液體的過多存在可能會影響脂肪酶的活性，從而導致酯化反應活性降低，棕櫚酸乙酯產率降低，因此，試驗中選擇離子液體用量為30%。

圖2 離子液體用量對微乳體系中脂肪酶催化酯化反應的影響

2.2 反應條件對脂肪酶催化合成棕櫚酸乙酯的影響

酯化反應是一個可逆反應，常通過增加反應物的量來提高反應轉化率，不同反應條件對離子液體微乳體系中脂肪酶催化酯化反應的影響如圖3所示。由圖3可見，當離子液體用量為30%，脂肪酶濃度為12%，反應時間為3.0 h時，不同醇酸摩爾比對棕櫚酸酯化反應的影響較大。在所考察的范圍內，隨著乙醇用量的增加，棕櫚酸乙酯產率逐漸上升，當醇酸摩爾比為6∶1時，棕櫚酸乙酯產率最高為95.8%，進一步增加乙醇用量，棕櫚酸乙酯產率下降。這是因為增加乙醇的濃度，即增加了反應物的濃度，有利于反應向酯化反應方向進行。但是隨著醇酸摩爾比進一步增加，反應體系中過高的乙醇濃度對脂肪酶活性有抑制作用，同時反應體系體積增大，催化劑濃度變稀，反應速度變慢，棕櫚酸轉化率下降。因此，醇酸摩爾比選為6∶1。

酶濃度的增加有利于反應速率增加，但是過量的酶也會對反應產生不利影響，本試驗在研究脂肪酶用量對棕櫚酸酯化反應的影響時，獲得了脂肪酶用量適宜值，具體結果見圖3，由圖可見，無脂肪酶存在時，該微乳體系中進行酯化反應具有一定的催化活性，而在TX-100/環己烷/BmimBF4微乳體系中進行催化酯化制備棕櫚酸乙酯時，棕櫚酸乙酯產率小于5%，由此說明微乳體系中DBSA不僅與TX-100結合作為表面活性劑與環己烷、離子液體形成微乳體系，還可作為Br?nsted酸催化酯化反應。有脂肪酶存在時，催化酯化反應活性進一步增加，且棕櫚酸轉化率隨著脂肪酶用量的增加而增加，當脂肪酶用量為12%時，棕櫚酸乙酯產率達到最大為95.8%，進一步增加脂肪酶用量，棕櫚酸乙酯產率增幅不明顯。這可能是因為酶濃度在一定范圍內增加時，隨著酶用量的增加，使得酶分子中越來越多的活性部位與底物分子接觸[24]，從而加快反應速度，使棕櫚酸轉化率快速增加；但當酶的活性部位增加到一定程度時，由于蛋白質的聚集作用而不再與底物接觸，反應速率即幾乎不再增加，棕櫚酸乙酯產率基本保持不變。因此選擇加酶量為12%。

溫度對酶催化反應的影響主要有兩個方面，提高反應溫度，一方面可以提高反應速率，另一方面過高的反應溫度會使酶失活，不利于酯化反應的進行。由圖3可見，隨著反應溫度的升高，反應速率加快，棕櫚酸轉化率增加，在35 ℃時棕櫚酸乙酯的產率達到最大值，脂肪酶此時表現出最大的催化活力。進一步升高反應溫度，雖然有利于DBSA的酸催化作用，但酶的催化活性受到抑制，兩者相互作用的結果，使得棕櫚酸乙酯的產率呈下降趨勢。

通常條件下，延長反應時間有助于反應進行。由圖3可見，脂肪酶存在時，隨著反應時間的延長，棕櫚酸乙酯產率增加，當反應時間為3.0 h時，棕櫚酸乙酯產率為95.8%，進一步延長反應時間，棕櫚酸乙酯產率基本保持不變。因此反應時間以3.0 h為宜。

圖3 不同反應條件對離子液體微乳體系中脂肪酶催化酯化反應的影響

2.3 響應面法優化生物柴油制備工藝

2.3.1 分析因素的選取及分析方案

根據 Box-Benhnken 的中心組合試驗設計原理，綜合單因素試驗結果，選取醇酸摩爾比、脂肪酶用量、反應溫度這三個因素，采用三因素三水平響應面分析方法確定棕櫚酸乙酯制備的最佳工藝條件，試驗因素水平及編碼表見表1，響應面實驗設計方案和實驗結果見表2。試驗1～12是析因試驗，13～17是中心試驗，中心試驗重復5次，用于估計試驗誤差。

表1 試驗因素水平及編碼表

表2 響應面實驗設計方案和實驗結果

2.3.2 模型的建立與顯著性檢驗

表3 二次多項式預測反應回歸模型的系數及方差分析結果

注：“*”表示該項具有顯著性效應；“**” 表示該項具有極顯著效應。

此外，失擬項的F值為3.58表明失擬項與絕對誤差不顯著，說明該模型能夠適用于本試驗的大部分數據，可以預測棕櫚酸乙酯生產過程中產率變化及各因素對產率的影響。綜上所述，該模型能夠用來預測本試驗，準確可靠。以棕櫚酸乙酯產率為響應值，通過RSM軟件對模型進行多元回歸分析，回歸方程的二次項系數見表3，該二次多項回歸方程可擬合為：

Y=+95.84+7.44A+2.13B-3.14C-8.14A2-16.22B2-11.20C2+4.08AB-1.05AC+0.13BC

2.3.3 因素間的交互影響

因素交互作用對棕櫚酸乙酯產率影響的等高線和響應曲面圖如圖4所示。可以看出各因素對棕櫚酸乙酯產率的影響，以及兩獨立因素間交互作用的強弱。

由圖4可知，當醇酸摩爾比和脂肪酶用量均為最小值時，隨著脂肪酶用量和醇酸摩爾比增加，酯化產率也逐漸增加。隨后，繼續增加醇酸摩爾比，棕櫚酸乙酯產率減小，這是因為過量的醇不利于酶活性表達，從而不利于棕櫚酸乙酯產率的提高。從圖4a和圖4d的等高線及響應曲面圖可以看出，脂肪酶用量和醇酸摩爾比的相互作用顯著，這與表3的分析結果一致。

反應溫度一定時，隨著脂肪酶用量的增加，棕櫚酸乙酯的產率持續增加，當脂肪酶用量達13%左右產率最高，繼續增加脂肪酶用量，產率變化不大。當脂肪酶用量保持不變時，隨著反應溫度的升高棕櫚酸乙酯的產率出現先逐步增長后降低的趨勢。較高的溫度不利于酶促反應的進行，所以當溫度升高時反應產率呈下降趨勢。

隨著醇酸摩爾比以及反應溫度的升高，棕櫚酸乙酯的產率呈現出逐漸升高的趨勢，達到峰值后繼續增加任一因素，產率都呈現下降趨勢。從圖 4c可以看出等高線圖呈圓形[25]，說明兩個因素間的交互作用不明顯，這也與表3分析結果一致。

2.3.4 最佳工藝條件的確定

結合回歸模型的數學分析可知，經過響應面優化法得到離子液體微乳體系中脂肪酶催化酯化反應的最佳條件是：離子液體用量30%，醇酸摩爾比6.26∶1，脂肪酶用量為棕櫚酸質量的13.99%，體系反應溫度是34.19 ℃，棕櫚酸乙酯的產率為98.09%。考慮到實際操作的方便，將最佳反應條件修正為離子液體用量30%，醇酸摩爾比6.3∶1，脂肪酶用量是14%，體系反應溫度是34 ℃。在最佳條件下進行3組平行實驗，棕櫚酸乙酯平均產率為97.5%，與理論預測值基本相符。因此，該回歸模型能夠真實地反應各因素對棕櫚酸乙酯產率的影響。

a

b

c

d

e

f

3 結 論

脂肪酶存在時，在DBSA+TX-100/環己烷/BmimBF4微乳體系中制備棕櫚酸乙酯具有較好的催化活性。微乳體系中DBSA一方面作為表面活性劑參與微乳體系的形成，同時作為Br?nsted酸催化酯化反應的進行，脂肪酶與DBSA的協同作用是使該酯化反應獲得較高產率的原因。

經過響應面優化，DBSA+TX-100/環己烷/BmimBF4微乳體系中脂肪酶催化合成棕櫚酸乙酯的較佳工藝條件為：離子液體用量30%，醇酸摩爾比6.3∶1，脂肪酶用量為棕櫚酸質量的14%，反應溫度34 ℃，反應時間3.0 h。在此條件下，棕櫚酸乙酯產率為97.5%。該結果與模型預測值基本相符。

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