南海4個花刺參地理群體的遺傳多樣性研究

文 菁，范嗣剛，李海鵬，胡超群

( 1.嶺南師范學院 生命科學與技術學院，廣東 湛江 524048； 2.中國水產科學研究院 南海水產研究所，廣東 廣州 510300； 3.廣州大學，廣東 廣州 510006； 4.中國科學院 南海海洋研究所，熱帶海洋生物資源與生態重點實驗室，廣東 廣州 510301 )

海參是一種珍貴的海產品，長期以來受到亞洲人民的喜愛。我國有約140種海參，可食用的約有20種[1]。花刺參(Stichopusmonotuberculatus)俗稱“黃肉參”，個體大、肉質軟糯，是重要的食品和醫藥原料，具有重要的經濟價值[1]。目前花刺參已成功突破人工繁育和幼苗養殖[2]，有望成為華南沿海地區養殖的新品種。目前有關花刺參的研究，主要有花刺參繁育[2]、種類鑒定與區分[3-4]、免疫[5-6]、養殖模式[7]、營養及化合物開發等方面[8-9]。

線粒體DNA序列具有結構簡單、重組率低、進化速度快和復制數多等特征，已廣泛用于水產養殖動物的遺傳多樣性研究[10-11]。在海參中，Skillings等[12]用cox1研究了19個黑海參(Holothuriaatra)群體的遺傳多樣性。Vergara-Chen等[13]用cox1和16S分析了5個H.polii的遺傳多樣性。So等[14]用cox1分析了20個北大西洋海參(Cucumariafrondosa)的遺傳結構。Uthicke等[15]用cox1分析了24個黑乳海參(H.nobilis)的遺傳多樣性。Arndt[16]用12S研究了11個Cucumariapseudocurata群體和5個C.miniata群體的遺傳結構。

文獻記載花刺參在我國海南島和廣西潿洲島有分布[1]。筆者在廣西潿洲島，海南臨高、三亞和瓊海采集到數目不等的花刺參個體，利用線粒體cox1基因序列分析這4個花刺參野生群體的遺傳多樣性，探討其群體關系，為花刺參的種質資源保護和管理提供基本資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2008—2009年，在潿洲島和海南島捕撈獲得花刺參野生個體(體長20～50 cm)，其中潿洲島采集到22個，群體命名為潿洲島，海南臨高采集了18個，瓊海15個、三亞28個(圖1)，共計83個個體。海參采集后，剪取每個個體的背部肌肉組織，用100%無水乙醇保存后帶回實驗室。

1.2 DNA提取、PCR擴增及測序

剪取海參樣品體壁組織約30 mg用雙蒸水洗凈, 滅菌吸水紙吸干水分。用海洋生物DNA提取試劑盒(TIANGEN，中國)提取DNA：體壁剪碎后，55 ℃水浴消化12 h后轉移到柱子，去蛋白，洗脫，50 μL TE溶解，離心后得到DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，-20 ℃保存備用。

圖1 4個花刺參群體取樣地點

花刺參線粒體cox1基因擴增引物為：COIef(5′-ATAATGATAGGAGGRTTTGG-3′)和COIer(5′-GCTCGTGTRTCTACRTCCAT-3′)[16]。PCR反應條件為：95 ℃ 60 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s隨后35個循環，94 ℃30 s，50 ℃30 s，72 ℃ 60 s; 最后72 ℃10 min。反應體系為50 μL：15 mmol/L MgCl2、100 μmol/L dNTPs、0.2 μmol/L正(反)引物、1 μLDNA模板、2 U Taq DNA聚合酶(Takara，日本)，ddH2O補平50 μL。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。用DNA膠回收試劑盒(Takara，日本)對目的片段進行回收，送至上海生工生物工程技術服務有限公司雙向測序。

1.3 數據分析

用Mega 7.0對所有序列進行比對。用Dnasp 4.0軟件計算多態位點數、單倍型多態性、核苷酸多態性和平均核苷酸差異數。用Mega 7.0的Kimura雙參數模型計算群體間的遺傳距離并構建系統進化樹，采用鄰接法來構建各單倍型間的鄰接進化樹。鄰接系統進化樹均進行1000次的自舉，計算分支支持率。使用軟件Network 4.5構建單倍型主干網絡關系圖。利用軟件Arlequin 3.01中的分子方差分析計算群體間和群體內的差異，通過1000次重復抽樣來檢驗不同遺傳結構水平上協方差的顯著性，采用分化固定指數來評估群體間的遺傳分化程度，通過1000次重復取樣來檢驗群體間分化固定指數的顯著性，采用Tajima′s D值進行中性檢驗。

2 結果與分析

2.1 群體內遺傳結構分析

所分析的花刺參4個群體中83個個體的cox1基因部分序列長665 bp。在這665個位點中，檢測到保守位點631個(94.89%)、多態性位點有34個(5.11%)，其中31個為簡約信息位點，3個為單突變位點，共檢測到23個單倍型，其中共享單倍型有6個，約為26.09%(6/23)。23個cox1單倍型序列的GenBank登陸號為KC424496KC424518。單倍型H1和H4在個群體中均有分布。有38個個體表現為H1；有16個個體表現為H4。H6分布在3個群體中，有4個個體。H2分布在三亞和潿洲島群體中，H3分布在臨高和潿洲島群體中，H5分布在三亞和潿洲島群體中。其余17個單倍型均為群體特異單倍型，約為73.91%(17/23)。三亞群體的特異單倍型最多(9個)，其次是瓊海群體(8個)。臨高群體和潿洲島群體沒有特異單倍型。

4個群體83個個體的平均單倍型多樣性和平均核苷酸多樣性分別為0.75522和0.00780(表1)。瓊海群體的單倍型多態性值和核苷酸多態性值最高，分別為0.96190和0.01684。臨高群體的單倍型多態性值和核苷酸多態性值最低，分別為0.30719和0.00128。

應用Tajima′s D值中性檢驗推測種群曾經歷的歷史時，如果Tajima′s D值呈負值，且在統計學上達到顯著標準，則說明序列中含有比中性進化模型更多的核苷酸位點變化，可能預示著被研究種群曾經經歷過一個擴張的歷史。在Tajima′s D統計中，臨高群體的D值為負(P<0.05)，說明臨高群體過去可能經受過群體擴張。潿洲島、三亞和瓊海的D值結果均不顯著(P>0.05)，符合中性進化模型。

表1 個花刺參群體的遺傳多樣性參數

注：*P<0.05，顯著差異；n.s.，差異不顯著(P>0.05).下同.

2.2 群體間遺傳結構分析

4個群體之間的分化固定指數和基因流見表2。三亞群體和瓊海群體之間，潿洲島群體和臨高群體之間均無遺傳分化(分化固定指數<0.05，P>0.05)。潿洲島群體和三亞群體之間的遺傳分化最小(分化固定指數=0.05942，P<0.05)，瓊海群體和臨高群體之間的遺傳分化最大(分化固定指數=0.33141，P<0.05)。臨高群體與潿洲島群體的基因流最頻繁(基因流=55.4910)，瓊海和臨高的基因流最小(基因流=1.0087)。4個花刺參地理種群的鄰接樹顯示，潿洲島群體和臨高群體聚在一起，然后再和三亞群體聚集，最外面為瓊海群體(圖2)。分子方差分析表明，群體內個體間的變異為87.20%，是總變異的主要來源；群體間的遺傳變異有12.80%，說明花刺參野生群體間有中等遺傳分化(表3)。

表2 4個花刺參群體間的遺傳分化系數和基因流

注：對角線上為基因流值，對角線下為遺傳分化值.

圖2 4個花刺參群體基于線粒體cox1基因序列的系統發育樹

變異來源自由度平方和方差分量變異率/%群體間34.0740.0499712.80群體內7926.8900.3403887.20共計8230.9640.39034

2.3 單倍型遺傳學關系

用Mega 7.0構建單倍型的鄰接樹(圖3)。來自不同群體的23個單倍型劃分為2個主要分支。第一個分支包括16個單倍型，來自4個群體，第二個分支包括7個單倍型，來自瓊海和三亞2個群體，未發現明顯的地理譜系結構。用Network構建單倍型的網絡關系圖顯示的單倍型關系和鄰接樹的基本一致(圖4)。單倍型H1為最多共享單倍型，位于網絡的擴展中心，可能是最原始的單倍型。

圖3 花刺參線粒體cox1基因單倍型鄰接樹

圖4 花刺參線粒體cox1單倍型間網絡結構

3 討 論

3.1 花刺參群體內遺傳多樣性

衡量一個群體mtDNA變異程度的指標主要是單倍型多態性和核苷酸多態性。單倍型多態性和核苷酸多態性的值越大，群體的遺傳多樣性越豐富。Vergara-Chen等[13]用cox1序列對海參H.polii的5個地理群體的遺傳多樣性進行調查，發現平均單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.8734和0.0050。So等[14]用cox1序列對北大西洋海參20個群體的遺傳多樣性進行調查，單倍型多態性為0.849～1.000，核苷酸多態性值為0.0018～0.0085。Uthicke等[15]用cox1序列對24個黑乳海參群體的遺傳多樣性進行調查，結果顯示平均單倍型多樣性為0.942，平均核苷酸多樣性為0.0075。本研究所涉及的4個花刺參群體83個個體的平均單倍型多樣性為0.75522，比上述3種海參群體的低，平均核苷酸多樣性為0.00780，比H.polii和黑乳海參群體的高。4個花刺參群體中，瓊海群體的遺傳多樣性相對最豐富，臨高群體的遺傳多樣性相對最低。潿洲島、三亞和瓊海群體的遺傳多樣性水平表現為高單倍型多態性，低核苷酸多態性的特點(單倍型多態性>0.5，核苷酸多態性<0.05)。這種遺傳結構一般是由一個較小的有效種群經過近期快速成長為一個大的種群所引起的。群體的快速擴張可產生許多新的突變，積累了單倍型的多樣性，但沒有足夠的時間來積累核苷酸序列的多樣性[13，17]。

3.2 花刺參各群體遺傳分化及相互關系

分化固定指數是亞群體間基因的分化比率。Weight[18]認為，分化固定指數<0.05表示種群間沒有遺傳分化；0.05<分化固定指數<0.15表示種群間的遺傳分化程度中等；0.15<分化固定指數<0.25表示種群間有高度遺傳分化；而超過0.25時表示種群間的遺傳分化極大。一般來說，幼苗為有浮游期的海洋底棲生物，其不同地理群體間的遺傳結構會很相似[14,19]。有研究表明，海參H.polii[13]、C.miniata[20]、北大西洋海參[14]和黑乳海參[15]不同地理群體之間遺傳分化很少，遺傳結構相似。Skillings等[12]發現，在夏威夷群島周邊珊瑚礁的黑海參中，有些群體間尚未遺傳分化，有些群體間有遺傳分化，認為黑海參群體間的地理距離和幼苗浮游路線是造成這種現象的原因。本研究結果與Skillings等[13]的研究結果相似。在花刺參個群體中，三亞群體和瓊海群體，潿洲島群體和臨高群體之間均沒有遺傳分化(分化固定指數<0.05，P>0.05)，但其他群體間均有不同程度的遺傳分化。

基因流，即每世代的平均遷移個體數是用來評判群體間基因流的參數。當基因流>1，表明群體間的基因流的水平較高，群體間可通過某種渠道，發生基因交流；當基因流>4時，種群間的基因交流頻繁；當基因流<1時，基因流有限，一般認為可能是有地理隔離的存在[21]。4個花刺參野生群體間的基因流均大于1，說明4個群體間都有基因流存在，沒有地理隔離。其中瓊海和臨高及潿洲島之間、臨高和三亞之間的基因流較少(1<基因流<4)。臨高和潿洲島群體間基因流最多，遺傳距離最近。單倍型的樹也表明不存在有地理譜系的單倍型。

[1] 廖玉麟. 中國動物志，棘皮動物門，海參綱 [M]. 北京: 科學出版社，1997.

[2] Hu C, Xu Y, Wen J, et al. Larval development and juvenile growth of the sea cucumberStichopussp.(Curry fish) [J]. Aquaculture, 2010, 300(1/4):73-79.

[3] Fan S G, Hu C Q, Zhang L P, et al.Complete mitochondrial genome of the sea cucumberStichopussp. and its application in the identification of this species[J]. Aquaculture Research, 2012,43(9):1306-1316.

[4] 文菁,胡超群,張呂平,等.16種商品海參16S rRNA的PCR-RFLP鑒定方法[J].中國水產科學,2011,18(2):451-457.

[5] Yan A, Ren C, Chen T, et al. Identification and functional characterization of a novel antistasin/WAP-like serine protease inhibitor from the tropical sea cucumber,Stichopusmonotuberculatus[J]. Fish & Shellfish Immunol, 2016, 59(1):203-212.

[6] Ren C, Chen T, Jiang X, et al. Two proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) paralogs from the tropical sea cucumber (Stichopusmonotuberculatus): molecular characterization and inducible expression with immune challenge[J]. Fish & Shellfish Immunol, 2016(56):255-262.

[7] 陳言峰,胡超群,任春華. 單一或二元的凡納濱對蝦新鮮養殖廢物用于花刺參養殖的研究[J]. 南方水產科學,2014,10(1):1-8.

[8] Wen J, Hu C, Fan S. Chemical composition and nutritional quality of sea cucumbers[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2010,90(14):2469-2474.

[9] 張佳佳. 花刺參中兩個新的四環三萜化合物[J]. 中草藥,2011,42(1):10-14.

[10] 趙丹,劉瑩,宋愛環,等. 基于線粒體COⅠ序列的泥螺群體遺傳多樣性研究[J]. 水產科學,2017,36(3):353-358.

[11] Zhou A, Zhuo X, Zou Q, et al. Population genetic diversity of the northern snakehead (Channaargus) in China based on the mitochondrial DNA control region and adjacent regions sequences[J]. Mitochondrial DNA, 2015, 26(3):341.

[12] Skillings D J, Bird C E, Toonen R J. Gateways to Hawai'i: genetic population structure of the tropical sea cucumberHolothuriaatra[J]. Journal of Marine Biology,2012(11):1-16.

[13] Vergara-Chen C, González-Wangüemert M, Marcos C,et al.Genetic diversity and connectivity remain high inHolothuriapolii(Delle Chiaje 1823) across a coastal lagoon-open sea environmental gradient [J]. Genetica, 2010, 138(8):895-906.

[14] So J J, Uthicke S, Hamel J F, et al.Genetic population structure in a commercial marine invertebrate with long-lived lecithotrophic larvae:Cucumariafrondosa(Echinodermata: Holothuroidea) [J]. Mar Biol, 2011, 158(4):859-870.

[15] Uthicke S, Benzie J. Gene flow and population history in high dispersal marine invertebrates: mitochondrial DNA analysis ofHolothurianobilis(Echinodermata: Holothuroidea) populations from the Indo-Pacific [J]. Mol Ecol, 2003, 12(10):2635-2648.

[16] Arndt A, Marquez C, Lambert P, et al.Molecular phylogeny of eastern Pacific sea cucumbers (Echinodermata：Holothuroidea) based on mitochondrial DNA sequence [J]. Mol Phylogen Evol,1996,6(3):425-437.

[17] Grant W, Bowen B. Shallow population histories in deep evolutionary lineages of marine fishes: insights from sardines and anchovies and lessons for conservation [J]. J Hered, 1998,85(5):415-426.

[18] Weight S. Evolution and the genetics of population variability within and among natural population [M]. Chicago: University of Chicago Press, 1978.

[19] Ball A O, Chapman R W. Population genetic analysis of white shrimp,Litopenaeussetiferus, using microsatellite genetic markers [J]. Mol Ecol, 2003, 12(9):2319-2330.

[20] Arndt A, Smith M. Genetic diversity and population structure in two species of sea cucumber: differing patterns according to mode of development [J]. Mol Ecol, 1998, 7(7):1053-1064.

[21] Millar C I, Libby W J. Strategies for conserving clinal, ecotypic, and disjunct population diversity in widespread species.Genetics and conservation of rare plants [M]. New York：Oxford University Press, 1991:149-170.