實驗動物微生物污染的人工凈化

李秀榮

(中國醫學科學院血液病醫院（血液學研究所），天津 300020)

0 引言

在科研工作中，實驗動物包括模式動物是我們研究人員的重要工具，大家對使用的實驗動物的要求也從普通級別（conventional animal,CV）上升到SPF級別（specific pathogen free animals），即無特定病原體實驗動物[1]。這些SPF級別實驗動物不含人畜共患的病原體，而且同樣不攜帶其它病毒、細菌以及支原體和衣原體等各種微生物和寄生蟲，遺傳背景清楚。但是在實際的繁殖、飼養和運輸中過程中，可能會接觸到各種病原微生物和寄生蟲，這些微生物和寄生蟲會對實驗動物自身的健康產生威脅，也同樣會對科研數據產生意想不到的干擾。所以通過各種方法對實驗動物進行微生物的凈化顯得尤為重要[2]。比較可行的方法有剖腹取胎技術和胚胎移植技術，兩種方法都是常用的微生物凈化技術，前者是最簡單而有效的手段；后者對轉基因動物的微生物凈化具有很好的優勢[3]。

1 實驗動物微生物凈化的理論基礎和技術可行性

凈化是將實驗動物中一些特定的病原微生物清除，使實驗動物達到一定清潔級別的方法。實驗動物的凈化首先是獲得無菌動物，而獲得無菌動物主要有剖腹取胎和胚胎移植兩個國際上公認的比較理想的種群凈化方法[4]。

1.1 微生物凈化的理論基礎

在實驗研究過程中，保持數據的可靠性、可復制性和科學性是實驗開展的基礎。在實驗過程中實驗動物往往會因為一些不可控因素而產生“污染”，例如外在微生物的污染以及內在遺傳漂變和遺傳污染。為防止這些的“污染”對實驗結果產生影響，必須對實驗動物進行凈化，以保證在實驗動物質量的可靠性和安全性。這種凈化是針對所有已知的病原微生物包括一些未知的可能對實驗動物造成傷害的微生物[5]。微生物的傳播可以根據方式不同，分為水平和垂直兩個方面，其中垂直傳播是指母子的方式，這種方式是先天性的；水平傳播是指外界環境的病原微生物通過各種方式影響著實驗動物，這是后天帶來的威脅。在這里必須強調，胎生動物的胎兒未離開胎盤以及卵生動物的卵未破殼，這樣的情況只有垂直傳播的可能性。胎盤屏障不僅是動物進化過程的自我保護，也在微生物凈化中起著隔離的作用。垂直傳播還有一個重要特點是只有母體動物在病毒血癥或者菌血癥等情況下，垂直傳播可以進行下去，而且也不是每個幼體都是百分之百的感染，這是進行凈化的重要基礎。

1.2 微生物凈化的技術可行性

1.2.1病原微生物的檢測水平目前的技術水平發展迅速，已經有很多的檢測手段和方法對各種病原微生物進行監測，有針對寄生蟲檢測的酶聯免疫吸附實驗（ELISA）、免疫熒光技術等；有針對細菌檢測的分離培養法和PCR法；有針對病毒檢測的血清ELISA法、PCR法等。現在隨著技術的進步，很多種簡易試劑盒也應運而生。只是這種監測是與目前的科學認知水平相接近的，以后隨著科技的發展，還會不斷得到加深[7]。

1.2.2剖腹取胎和胚胎移植的無菌手術操作。由于自然分娩的產道與外界相通，是污染的環境，所以胎生動物或者卵生動物都需要在無菌的情況下取出胎兒或者卵。目前不管是無菌的子宮切除取胎還是剖腹取胎都是可以達到的[8]。

2 實驗動物微生物凈化的案例

微生物凈化主要有剖腹取胎方法和胚胎移植技術兩種，這里主要介紹剖腹取胎方法。胎盤是天然的隔離各種微生物的有效屏障，采取無菌剖腹產手術，可以切斷動物母子垂直的疾病傳播，是微生物凈化最簡單和最有效的手段之一[10]。該方法需要人為控制交配時間，在進行子宮切除取胎或者剖腹取胎后要明白每種動物不同的生理特性，根據不同動物妊娠時間，預留無菌手續取胎和無菌孵化時間。常用實驗動物妊娠期時間長短如下表1所示；還要注意每種動物不同的哺乳期和喂養次數以及斷乳時間（表2所示），以期很好的喂養實驗用動物幼崽[11]。

表1 常用實驗動物妊娠期

下面簡單介紹小鼠的剖腹產凈化手術以及喂養過程。

2.1 妊娠期和剖腹產時間確定

隨機選擇10只雄鼠和20只雌鼠進行配種，檢查陰栓判斷是否配種成功，記錄陰栓時間并分籠飼養；根據上述表1的妊娠時間，發現陰道處于開口狀態，手指觸摸到胎兒的頭和腰大小類似時候，可以進行剖腹產手術[12]。

表2 常用實驗動物哺乳期以及每日哺乳次數和斷乳時間

2.2 剖腹產手術

剖腹產手術一定要保證絕對的無菌環境。手術的器械（止血鉗、剪刀等）、紗布等事先經過高壓滅菌；手術室提前進行紫外線照射消毒；斷頸椎處死母鼠，放在提前預熱至37度的2%過氧乙酸中進行表面消毒，而后將小鼠置于解剖盤，剪開腹部皮膚，將子宮暴露，先用止血鉗固定住子宮頸，剪斷子宮后放置預熱至37度的2%過氧乙酸中浸泡消毒2s，用生理鹽水沖洗干凈，最后打開子宮取出仔鼠。采用人工乳或者提前準備好的代乳喂養[13]。

實驗中20只雌鼠，成功受孕分娩的小鼠有14只，它們各自的妊娠時間如下表3所示，最短時間是18天，最長時間是20天。

表3 小鼠妊娠期

2.3 代乳母鼠喂養

在有凈化的無菌動物的前提下，優先選擇母乳代乳。代乳母鼠的選擇遵照品系相同、健康、產過一胎，有哺乳經驗，而且仔鼠成活率高的原則，代乳小鼠的產期和剖腹取胎的時間要接近，一般在剖腹產小鼠之前1-2天分娩，將剖腹產小鼠粘上代乳小鼠的糞便或者墊料進行染味，由代乳小鼠進行哺乳[14]。我們采用代乳方式，仔鼠的存活率為100%。

2.4 注意事項

第一，要保證環境以及所用的器具無菌，杜絕人為帶入污染。第二，在處死剖腹母鼠-取子宮-剝離胎兒等步驟要一氣呵成，速度要快，避免胎兒長時間離開母體，造成窒息死亡。第三，要根據實驗動物的生理特征，計算好妊娠時間和剖腹的時間，并且結合手指觸診的經驗，確定剖腹的時間，剖腹太早可能由于仔鼠發育未成熟導致成活率降低；太晚剖腹又有剖腹小鼠提前自然分娩的可能。第四，在進行剖腹手術過程中，接近室溫的溫度是保證手術成功的重要因素，過高或過低的溫度都不利于仔鼠的存活[15]。最后，對剖腹產的仔鼠進行染味時候，一定要充分，避免代乳母鼠不飼喂哺乳。

3 結語

實驗動物的微生物凈化是一個連續的過程，上述提到的剖腹產凈化是其中的一個步驟，制備好的凈化動物還需要不斷的繁殖，在這個過程中，飼養環境也顯得尤為重要，實驗動物設施的隔離屏障系統是防止動物感染的一道重要屏障，現在動物實驗都有潔凈的IVC系統，但是操作人員的合規操作很重要，需要嚴格按照無菌操作規程進行實驗動物的飼養，同時要定期檢查動物飼養系統的各種指標，以防整個系統出現故障，造成實驗動物大規模的發生微生物的污染。

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