樟樹葉木脂素大孔吸附樹脂純化工藝優化

伍平香WU Ping-xiang 李忠海 -

(1. 中南林業科技大學，湖南 長沙 410004；2. 稻谷及副產物深加工國家工程實驗室，湖南 長沙 410004)

樟樹(Cinnamomumcamphora)是一種廣布于中國長江以南及西南地區的樟科(Lauraceae) 樟屬(Cinnamomum)植物，生長快，材質優良，是江南四大名木之一，被譽為江南寶樹[1]。樟樹作為傳統中藥材，具有抑菌、消炎、止痛、抗癌、抗氧化及提高人體免疫力等功效[2-3]。目前，大量研究表明樟樹葉中木脂素類化合物含量較高[4]，該類化合物作為一種天然植物雌激素，可分為木脂素(lignan)和新木脂素(neolignan)兩大類[5]，廣泛分布于植物的莖、葉、花、種子、果實等部位[6]。木脂素又稱木脂體或木酚素，由苯丙素單位(C6—C3)聚合而成[7]，多數呈游離態，少數與糖結合成苷。研究[8-10]表明，木脂素具有抑菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、保護肝臟以及調節膽固醇等多重功效。

近年來，大孔吸附樹脂被廣泛應用于天然產物的分離純化，只因其具有比表面積大、吸附容量大、理化性質穩定、吸附速度快、選擇性較好、解吸條件溫和、強度好、使用周期長、節省費用等優勢[11-12]。陳曉宇等[13]通過靜態和動態試驗對5種大孔樹脂進行篩選，確定AB-8大孔樹脂對五味子木脂素純化效果較好，并在最佳純化條件下用50% 和70% 乙醇進行洗脫，最終測得五味子木脂素的含量由11.68% 提高到41.48%。雷燕萍[14]考察了大孔吸附樹脂對雪松松針木脂素純化效果，在最佳純化工藝條件下進行動態吸附、解吸，最終得到平均含量為57.77% 的雪松松針木脂素提取物。目前，對樟樹葉中木脂素的研究主要是提取工藝，而對于其純化工藝條件的研究還不夠系統、全面。因此，本研究首先選擇6種不同類型大孔樹脂進行吸附解吸性能考察，綜合考慮后選擇其中最優的大孔樹脂進行考察以確定樟樹葉中木脂素最佳純化工藝條件，為樟樹葉中木脂素類化合物進一步分離純化提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

樟樹葉：小葉樟，于2016年3月采自中南林業科技大學校區；

無水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇：分析純，天津市恒興化學試劑制造有限公司；

變色酸：分析純，上海源葉生物科技有限公司；

芝麻素標準品、五味子酯甲標準品：色譜純，上海源葉生物科技有限公司；

濃硫酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

大孔樹脂：AB-8、X-5、D101型，安徽三星樹脂科技有限公司；

大孔樹脂：HPD450、HPD722、HPD600型，東鴻化工有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

電子天平：FA1104型，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；

旋轉蒸發儀：Hei-VAP Precision型，德國Heidolph公司；

分光光度計：721G型，天恒科學儀器設備有限公司；

電熱鼓風干燥箱：101-2AB型，天津市泰斯特儀器有限公司；

真空干燥箱：DZF-6050型，上海博訊實業有限公司；

高速萬能粉碎機：FW200型，北京科偉永興儀器有限公司；

超聲波清洗機：SB25-12D型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

電腦全自動收集器：DBS-100型，上海滬西儀器廠有限公司；

玻璃層析柱：Φ15 mm×200 mm，上海五相儀器儀表有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品溶液制備 樟樹葉清洗、晾干，105 ℃烘箱內殺青30 min、再將烘箱調至70 ℃將樟樹葉烘干，粉碎過60目篩，熱回流提取3次，過濾合并濾液，濃縮，依次經石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，取乙酸乙酯層進行濃縮，乙醇溶解浸膏得粗提液、備用。

1.2.2 標準曲線繪制 根據文獻[15]，以五味子酯甲為標準品，測得標準曲線方程為：y=11.327 5x+0.022 77，相關系數R2=0.999 5。

1.2.3 大孔吸附樹脂篩選

(1) 大孔吸附樹脂預處理：先用95% 乙醇將大孔樹脂浸泡24 h，使其充分溶脹，濕法裝柱，再依次用 95% 乙醇、適量蒸餾水沖洗柱子，并觀察流出液，當流出液中無白色渾濁現象且樹脂柱無醇味后停止沖柱，然后用5% NaOH溶液浸泡3 h，純水洗至pH值為中性，最后用4% HCl溶液浸泡3 h，純水洗至流出液為中性，放置陰涼處晾干備用[16]。不同大孔樹脂的物理結構參數見表1。

表1 不同大孔樹脂的物理結構參數Table 1 Physical properties of different macroporous resins

(2) 不同大孔吸附樹脂對木脂素靜態吸附與解吸試驗：精密稱取已處理好的6種不同類型大孔樹脂各5.0 g于錐形瓶中，加入質量濃度為2.65 mg/mL木脂素粗提液 30 mL，密封，置于25 ℃恒溫搖床中振搖24 h，速度為60 r/min，待吸附完全后，過濾，測定濾液中木脂素的質量濃度。吸附完全的6種樹脂用100 mL蒸餾水沖洗至表面無提取液殘留及其他雜質，用濾紙吸干表面水分，加入50 mL體積分數為90% 的乙醇，密封置于25 ℃ 恒溫搖床中， 60 r/min轉速振搖24 h，充分解吸后，過濾，測定濾液中木脂素的質量濃度，按式(1)～(4)計算各樹脂的比吸附量、吸附率、比解吸量與解吸率[17]。

(1)

(2)

(3)

(4)

式中：

Q1——比吸附量，mg/g;

W1——吸附率，%；

Q2——比解吸量，mg/g;

W2——解吸率，%；

C0——吸附前樣品中木脂素質量濃度，mg/mL；

C1——吸附后濾液中木脂素質量濃度，mg/mL；

V1——粗提液體積，mL；

M——樹脂質量，g；

C2——解吸液中木脂素質量濃度，mg/mL；

V2——解吸液體積，mL。

(3) 大孔吸附樹脂的動態吸附-解吸試驗：精密稱取處理過的3種大孔樹脂(X-5、AB-8、D101型)各5.0 g，濕法裝柱，準確量取2.65 mg/mL樟樹葉木脂素粗提液30 mL 進樣，控制上樣速度為1.5 mL/min，收集流出液，再用100 mL純水沖洗樹脂柱，最后用50 mL體積分數為 90% 的乙醇進行解析，收集解吸液。測定流出液及解吸液中木脂素的含量，并分別按式(2)、(4)計算其吸附率及解吸附率。

1.2.4 大孔吸附樹脂(AB-8型)靜態吸附-解吸試驗

(1) 大孔樹脂吸附-解吸動力學曲線：精密稱取預處理過的大孔樹脂5.0 g于錐形瓶中，加入 2.65 mg/mL 木脂素粗提液30 mL，密封于25 ℃恒溫搖床中以60 r/min振搖。分別吸附 2，4，6，8，10，12，24 h 后從錐形瓶中精密吸取0.05 mL 上清液，測定其中木脂素粗提液質量濃度，繪制靜態吸附動力學曲線；按照1.2.3中解吸方法，分別解吸2，4，6，8，10，12，24 h后從錐形瓶中精密吸取0.05 mL解吸液，測定其中木脂素質量濃度，計算解吸液中木脂素含量，繪制靜態解吸動力學曲線[18]。

(2) 上樣質量濃度對吸附效果的影響：精密稱取預處理過的大孔樹脂5.0 g于錐形瓶中，加入50 mL質量濃度分別為0.53，1.06，1.59，2.12，2.65 mg/mL的木脂素粗提液，密封置于25 ℃恒溫搖床中，以60 r/min振搖8 h，充分吸附后，過濾，測定濾液中木脂素的質量濃度，計算吸附率。

(3) 乙醇體積分數對解吸效果的影響：精密稱取預處理過的大孔樹脂7份各5.0 g于錐形瓶中，加入30 mL 質量濃度為2.12 mg/mL 的木脂素粗提液，密封置于25 ℃ 恒溫搖床中，以60 r/min 振搖8 h，充分吸附后，過濾，測定濾液中木脂素的質量濃度，用100 mL 蒸餾水沖洗濾出的樹脂至其表面無提取液殘留，濾紙吸干水分后，加入50 mL 體積分數分別為10%，30%，50%，70%，80%，90%，95% 的乙醇溶液，密封置于25 ℃恒溫搖床上進行振搖，在60 r/min 條件下振搖10 h，充分解吸后，過濾，測定濾液中木脂素的質量濃度，計算解吸液中木脂素含量。

1.2.5 最適大孔樹脂動態吸附-解吸的正交試驗優化 根據大孔樹脂靜態吸附-解吸試驗結果選擇2.12 mg/mL 樣品為上樣液、80%乙醇為洗脫劑進行動態吸附-解吸條件考察。以下試驗均采用濕法裝柱于Φ15 mm×200 mm玻璃層析柱中。

(1) 上樣量：精密量取濃度為2.12 mg/mL的樟葉木脂素提取液8 BV，以1 mL/min 的上樣速率經過樹脂柱，以1 BV 為單位分段收集流出液。按照1.2.2中方法測定流出液中木脂素濃度，繪制泄露曲線。其中，橫坐標為流出液體積，縱坐標為木脂素質量濃度，由泄露點[19]來確定其最大上樣量。

(2) 上樣流速：精密量取6 BV 濃度為2.12 mg/mL 的樟葉木脂素粗提液5份，分別以0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL/min 上樣速率進行動態吸附，待吸附完全，以10 mL 為單位收集流出液，按照1.2.2中方法測定流出液中木脂素濃度，計算樹脂的吸附量。

(3) 洗脫速率及洗脫劑用量：將質量濃度為 2.12 mg/mL 樟樹葉木脂素粗提液以1.5 mL/min的速率上樣，待吸附完全，先用7 BV 去離子水洗脫，再用體積分數為 80%乙醇溶液分別以1，2，3，4，5 BV/h速度進行解吸附洗脫，以1 BV 為單位分段收集解吸附液，按照1.2.2中方法測定解吸液中木脂素質量濃度，以洗脫體積為橫坐標，洗脫速率為縱坐標繪制洗脫曲線。

(4) 正交試驗：由于動態試驗更能真實地反映大孔樹脂對木脂素的吸附-解吸過程，因此在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗優化大孔樹脂動態吸附-解吸過程。

1.2.6 木脂素得率及純度測定 參照文獻[20]，根據式(5)計算樣品中木脂素得率。

(5)

式中：

P1——木脂素得率，%；

C2——解吸液中木脂素質量濃度，mg/mL；

V2——解吸液體積，mL；

C0——吸附前溶液中木脂素質量濃度，mg/mL；

V0——吸附前溶液體積，mL。

2 結果與分析

2.1 大孔吸附樹脂篩選

2.1.1 不同大孔吸附樹脂靜態吸附與解吸性能 由表2可知，X-5、AB-8、D101型3種大孔樹脂的吸附及解吸性能均優于其他3種，但是從X-5、AB-8、D101型3種大孔樹脂的吸附及解吸情況來看，3種樹脂的靜態吸附及解吸性能比較相近，因此，需要進一步考察3種樹脂動態吸附及解吸性能，從而選出最適合純化樟樹葉木脂素的大孔樹脂。

2.1.2 大孔吸附樹脂(X-5、AB-8、D101)動態吸附-解吸性能 由圖1可知，X-5、AB-8、D101型3種大孔樹脂的吸附率差異不顯著，但是AB-8型大孔樹脂的解吸率明顯高于其他2種，可能是該樹脂的極性與木脂素分子極性更相近，綜合考慮，大孔樹脂AB-8型為最優純化材料。

2.2 大孔吸附樹脂(AB-8型)靜態吸附-解吸試驗結果分析

2.2.1 大孔吸附樹脂靜態吸附-解吸動力學曲線 由圖2可知，樟樹葉中木脂素吸附量和解吸量分別在8，10 h 后增加緩慢，基本達到平衡，說明該大孔樹脂吸附、解吸時間較長。

2.2.2 上樣液質量濃度對吸附性能的影響 圖3表示上樣濃度對大孔樹脂吸附率的影響。由圖3可知，隨著樣品濃度的增加，大孔樹脂的吸附率呈現上升趨勢，可能是濃度較低時，樟樹葉提取液中木脂素分子可以與樹脂充分接觸，使其快速擴散至樹脂內部而被吸附；當上樣液的濃度為2.12 mg/mL時，吸附性能最好，吸附率最大，之后隨濃度增加大孔樹脂對木脂素的吸附能力略有下降，可能是上樣液質量濃度太高時使得樹脂內部的提取液中分子擴散受到抑制，導致樹脂的吸附量緩慢下降，也有可能隨上樣液濃度增加其中所含雜質也增多，樹脂吸附雜質的量也增加使其吸附性能下降[21]。故選擇濃度為2.12 mg/mL 的木脂素溶液進行上樣。

表2 6種樹脂吸附及解吸性能?

Table 2 Adsorption and desorption capacity of six macroporous resins towards lignans (n=3)

樹脂型號比吸附量/(mg·g-1)吸附率/%比解析量/(mg·g-1)解吸率/%X-512.04±2.62ac74.10±4.7ab8.41±0.68b71.35±1.87ac AB-813.23±1.94a77.09±3.62a11.06±1.61a74.45±1.97a D10112.34±2.44ac70.81±2.32b9.24±0.96b70.37±2.13ac NKA-96.72±1.14d38.61±2.78d3.87±1.17c50.37±3.63d HPD7207.28±1.21bd45.49±3.03c4.23±0.48c54.26±2.69bd HPD6004.24±0.76d21.45±1.79e1.30±0.33d31.26±2.75f

? 同列中不同字母代表差異性顯著(P<0.05)。

2.2.3 乙醇體積分數對解吸性能的影響 由圖4可知，乙醇體積分數較低時，大孔樹脂的解吸率也很低，隨乙醇體積分數增大，解吸率逐漸上升即解吸液中木脂素的含量隨之增大，當乙醇體積分數為80% 時，解吸液中木脂素含量最高，繼續增加乙醇濃度，木脂素含量呈下降趨勢。這可能是由于木脂素分子利用氫鍵作用力吸附在大孔樹脂上，乙醇體積分數的提高加大了對氫鍵的破壞，所以解吸率隨著升高[22]。當乙醇體積分數超過80% 后，由于乙醇溶液與木脂素極性差異導致吸附在樹脂上的木脂素得不到充分溶解，所以解吸率呈下降趨勢。因此，選擇體積分數為80% 的乙醇溶液進行洗脫。

不同字母代表差異性顯著(P<0.05)圖1 X-5、AB-8、D101型大孔樹脂動態吸附、解吸性能

Figure 1 The capacity of dynamic adsorption and desorption of X-5, AB-8 and D101 macroporous resins towards lignans (n=3)

圖2 AB-8型大孔樹脂靜態吸附-解吸動力學曲線

Figure 2 The kinetic curve of static adsorption and desorption of AB-8 macroporous resin (n=3)

圖3 上樣液質量濃度對吸附性能的影響Figure 3 Inuence of sample concentration on the adsorption efficiency (n=3)

2.3 大孔吸附樹脂(AB-8型)動態吸附及解吸優化結果

2.3.1 上樣量的考察 由圖 5可知，當對提取液進行上樣吸附時，隨著上樣量的增加，收集的流出液中木脂素濃度隨之增大，當流出液體積達到 6 BV 時，木脂素濃度達到 0.21 mg/mL，約為上樣液濃度的10%，即達到泄露點[23]，因此確定最大上樣量為 6 BV左右最適。

圖4 乙醇體積分數對解吸效果的影響Figure 4 Inuence of ethanol concentration on the adsorption efficiency (n=3)

圖5 泄露曲線Figure 5 The divulge curve (n=3)

2.3.2 上樣速率考察 由圖6可知，流出液中木脂素濃度隨上樣速度增加而上升。原因是流速主要影響提取液中溶質分子向樹脂表面擴散，當流速過大時，粗提液中的分子還沒來得及被樹脂吸附，就已經流出層析柱；而流速較慢時，溶液中的木脂素分子可以和樹脂充分接觸，吸附率較高，但如果流速過慢，會使過柱時間過長[24]。綜合考慮，以1.5 mL/min 速率進行上樣。

圖6 上樣速度對吸附性能影響Figure 6 Inuence of sample loading ow rate on the adsorption efficiency (n=3)

2.3.3 洗脫速率及洗脫劑用量考察 由圖7可以看出，洗脫流速對大孔樹脂洗脫效果影響較明顯，流速較慢時，樟樹葉木脂素洗脫峰相對集中；流速越快，洗脫峰越寬，拖尾現象越明顯，導致洗脫劑體積增加[25]。而實際應用中洗脫流速過慢會延長解吸時間，綜合考慮，選擇2 BV/h左右進行后續試驗考察。由此流速條件下洗脫曲線圖可以確定洗脫體積在8 BV 比較合理。

2.3.4 正交試驗優化結果分析 根據單因素試驗結果，選取上樣量、上樣速率、洗脫速率及洗脫劑用量4 個因素，每個因素考察4 個水平，進行L16(45)正交試驗，以80% 乙醇溶液洗脫木脂素得率以及純度作為評價標準，正交試驗因素水平見表3。

圖7 解吸流速對洗脫效果的影響Figure 7 The effect of different desorption velocity on desorption efficiency (n=3)

由表4可知，各因素對木脂素得率影響程度為：上樣量>洗脫劑用量>上樣流速>洗脫流速。AB-8型大孔樹脂純化過程中影響木脂素純度的因素為：上樣量>洗脫流速>洗脫劑用量>上樣流速，通過測定木脂素得率及純度發現各因素對AB-8型大孔樹脂的吸附-解析能力影響程度不同，其中，上樣量對其純化效果影響較大。

以木脂素純度為指標考察各因素對AB-8型大孔樹脂純化效果，通過比較各影響因素的均值可知，A因素的第4水平較好，B、C和D 因素分別是第1、2、3 水平較好，得出AB-8型大孔樹脂的動態吸附-解吸最佳純化工藝條件為A4B1C2D3；而以木脂素得率為指標考察各因素對AB-8型大孔樹脂純化效果可以得出最佳純化工藝條件為A4B2C1D3。高純度的木脂素產品市場應用范圍更廣，獲得的經濟效益更高，而高得率木脂素可減少其在提取純化過程中的損失量，降低成本。綜合考慮木脂素得率和純度，選擇純化工藝最優條件為A4B1C2D3，即上樣量7 BV、上樣速率1.0 mL/min、洗脫流速2 BV/h，洗脫劑用量8 BV。

表3 正交試驗因素水平表Table 3 Factors and levels of the experiment

表4木脂素動態吸附-解吸正交試驗設計及結果

Table 4 Orthogonal array design and results for optimization of dynamic adsorption and desorption of lignans

序號ABCDE空列P1得率/%P2純度/%11233262.5011.07 22412259.289.11 33434353.117.86 44211365.8215.65 51314451.119.02 62131457.699.83 73113167.1315.85 84332161.5411.56 91142358.2910.97 102323356.3412.67 113341254.3811.42 124124266.4116.82 131421158.2811.43 142244152.239.65 153222457.6811.33 164443467.3315.29 純度K110.6213.3712.4112.0812.12K210.3211.9313.0610.7412.11K311.6211.1710.0613.7211.79K414.8310.9211.8310.8411.37R14.212.453.002.980.75 得率K157.5562.3860.8459.0459.80K256.3859.5759.6859.2060.65K358.0855.8458.7263.3358.39K465.2859.5058.0655.7258.45R28.906.542.187.162.26

2.3.5 樹脂最佳工藝條件驗證實驗 通過靜態吸附、解吸試驗以及正交優化AB-8型大孔樹脂動態吸附、解吸條件，得到最佳純化工藝條件為：上樣量7 BV，上樣濃度2.12 mg/mL，上樣流速1.0 mL/min，洗脫劑乙醇體積分數80%，洗脫流速2 BV/h，洗脫劑用量8 BV，在此條件下進行3次平行實驗，得木脂素得率分別為69.79%，67.68%，62.58%，平均得率為66.68%；純度分別為15.89%，18.57%，13.28%，平均純度為15.91%。結果表明該工藝條件可靠。

3 結論

本試驗首先對 6種大孔吸附樹脂進行比較，最終確定 AB-8型大孔吸附樹脂為樟樹葉中木脂素純化的最佳材料。然后，通過靜態吸附-解吸、動態吸附-解吸單因素試驗以及正交試驗得到該工藝的最佳純化條件，并在最優條件下測得木脂素得率和純度分別為66.68%，15.91%，較純化前木脂素含量明顯提高，說明優化確定的工藝參數可行，為樟樹葉中木脂素的工業化生產以及研究提供一定理論依據。

目前，雖然大孔吸附樹脂技術應用廣泛，但是在工業化生產中，單獨使用此技術可能使得分離純化效果不理想，因此將大孔吸附樹脂與其他新技術如超臨界流體萃取、微濾法等相結合成為今后分離純化技術發展的一種重要趨勢。另外，由于大多數樹脂為人工合成，在使用過程中會將一些有機殘留物混入到產物中，影響產物的安全性[26]，因此，有必要開發一些安全高效的新型樹脂。

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