雅津蛋白桑多糖的分離純化及生物活性研究

王羚佳WANG Ling-jia 舒曉夢 - 辛 文 張馳松 - 陳祥貴 - 楊 瀟

(1. 西華大學食品與生物工程學院，四川 成都 610039；2. 成都市農林科學院，四川 成都 611130)

桑葉為桑科(Moraceae)植物桑(MorusalbaL.)的葉，目前已被衛生部認定為藥食兩用植物[1]。已有的研究表明，桑葉多糖具有調節人體代謝和清除自由基的功能[2]；其機制涉及抑制糖代謝相關酶類及抗氧化[3]。 雅津蛋白桑又稱飼料桑，是中國培育的新型桑樹品種，具有區域適應性和抗逆性強、蛋白質含量高、產量高等的優點，已在中國多個地區大力推廣，開發前景十分廣闊[4]。

目前對桑葉多糖的研究主要集中于提取方法、多糖成分表征、單一多糖成分的純化和生物活性鑒定[5]。在多種植物多糖提取方法中酶解法操作條件相對溫和，對提取物的生物活性損傷小，提取效率高，有較大的實用價值[6]。在多糖生物活性研究中也發現不同分子量的桑葉多糖成分表現出了不同的生物活性[3,7-8]。但從雅津蛋白桑葉中提取多糖作為功能性食品原料使用時，考慮到生產成本，通常采用總多糖為原料，而對雅津蛋白桑葉總多糖的酶法提取與純化及其生物活性方面的研究卻無相關報道。本研究利用正交試驗優化了纖維素酶法提取雅津蛋白桑葉多糖的工藝條件，再采用Sephadex G-100 型葡聚糖凝膠對多糖進行純化，并比較純化前后多糖的生物活性，為以雅津蛋白桑葉為原料的桑葉多糖在食品領域的進一步開發和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

雅津蛋白桑桑葉：成都市農林科學院；

濃硫酸、苯酚、無水乙醇、三氯乙酸、葡萄糖、抗壞血酸、鐵氰化鉀、三氯化鐵、硫酸亞鐵、磷酸二氫鈉、水楊酸、磷酸氫二鈉、H2O2(30%)、無水碳酸鈉、蔗糖：分析純，成都市科龍化工試劑廠；

1，1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH)、對硝基苯-β-D-半乳糖吡喃糖苷(pNPG)：美國Sigma公司；

纖維素酶、α-葡萄糖苷酶：上海源葉生物科技有限公司；

制備液相色譜儀：AKTA purifier 10型，美國GE公司；

多功能酶標儀：Infinite F500型，瑞士TECAN公司；

電子天平：BSA224型，德國Sartorius公司。

1.2 桑葉多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法[9]。

1.3 纖維素酶法提取桑葉多糖

將新鮮桑葉用蒸餾水沖洗干凈，除去表面雜質，凍干粉碎，100目過篩待用。準確稱量桑葉粉10.00 g，置于圓底燒瓶中，加入100 mL蒸餾水[料液比1∶10 (g/mL)]，適量纖維素酶，充分震蕩，使其溶解。調節pH值，在一定溫度下酶解。并在80 ℃下回流60 min提取多糖。提取液冷卻后抽濾，濾液中加入10 mL三氯乙酸，混勻后4 ℃過夜以沉淀蛋白。過濾，濾液于4 ℃、5 000 r/min離心10 min，棄沉淀。取上清液加入4倍體積的無水乙醇，于4 ℃ 過夜沉淀多糖。4 ℃、5 000 r/min離心10 min去上清，沉淀于-40 ℃冷凍干燥后待用。

1.3.1 單因素對纖維素酶法提取多糖得率的影響 根據文獻[10]，酶解pH、酶解溫度、酶解時間和酶濃度是影響酶法提取多糖得率的主要因素。為了解各因素變化對多糖得率的影響，選取酶解pH、酶解溫度、酶解時間和酶濃度進行單因素試驗。

(1) 酶解pH的影響：固定纖維素酶濃度2%、酶解溫度 55 ℃、酶解時間50 min，分別比較pH為 4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0時對多糖得率的影響。

(2) 酶解溫度的影響：固定纖維素酶濃度2%、酶解pH 6.0、酶解時間50 min，分別比較酶解溫度為45，50，55，60，65 ℃ 時對多糖得率的影響。

(3) 酶解時間的影響：固定纖維素酶濃度2%、酶解pH 6.0、酶解溫度 55 ℃，分別比較酶解時間為10，20，30，40，50，60，70 min時對多糖得率的影響。

(4) 酶濃度的影響：固定酶解時間50 min、酶解pH 6.0、酶解溫度 55 ℃，分別比較纖維素酶濃度為0.0%，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%，3.5%，4.0%時對多糖得率的影響。

1.3.2 正交優化試驗 在單因素試驗的基礎上，選取pH、溫度、酶濃度和酶反應時間四因素的最優水平進行正交試驗，對酶法提取桑葉多糖的工藝條件進行進一步優化。

1.4 桑葉多糖的純化

參考應芝等[11]的研究，選用 Sephadex G-100 型葡聚糖凝膠為填料，以蒸餾水為流動相。準確稱取100 mg桑葉粗多糖溶于5 mL蒸餾水。將樣品溶液上柱，以流速為2 mL/min 洗脫，每管收集5 mL洗脫液。每管取100 μL用苯酚-硫酸法在490 nm處測定吸光度。根據每管洗脫液的多糖含量繪制洗脫曲線，合并同一洗脫峰的洗脫液，經截留分子量為3 000 Da 的超濾離心管，4 ℃、7 000 r/min離心30 min 濃縮，收集濃縮液于-40 ℃冷凍干燥后待用。

1.5 桑葉多糖總抗氧化能力的測定

參考Benjakul等[12]的方法(普魯士藍法)并修改如下：取1 mL不同濃度(0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL )桑葉總多糖溶液，依次加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/mL，pH 6.6)，2.5 mL 鐵氰化鉀溶液 (1 g/mL)混勻，于50 ℃下孵育20 min，冷卻后加入2.5 mL 三氯乙酸溶液(10 g/100 mL)混勻，從中取出 2.5 mL再加入 2.5 mL蒸餾水和 0.5 mL三氯化鐵溶液 (1 mg/mL)，常溫下反應 20 min后于波長700 nm處測定吸光度值，多糖的總抗氧化能力與吸光度值正相關。

1.6 桑葉多糖對DPPH 自由基的清除能力

為比較純化前后桑葉總多糖對DPPH 自由基的清除能力，根據文獻[13]修改如下：分別取2 mL 不同濃度(0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mg/mL)的桑葉總多糖溶液，加入2 mL DPPH-乙醇溶液 (0.1 mmol/L)混勻，室溫下避光孵育 30 min，并于517 nm處測定吸光度值。根據式(1)計算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

d——DPPH清除率，%；

Ai——測定樣品的吸光度值；

Aj——采用乙醇替換DPPH-乙醇溶液時樣品的吸光度值；

A0——樣品被蒸餾水代替時測定的吸光度值。

根據清除率，并參照馮艷萍等[14]報道的方法計算半抑制濃度(IC50值)。

1.7 桑葉多糖對羥自由基(·OH)的清除能力

參考Feton反應的方法[15]修改如下：取0.5 mL濃度分別為0.40，0.80，1.20，1.60，2.00 mg/mL的桑葉總多糖溶液，再加入1 mL硫酸亞鐵溶液(6 mmol/L)， 1 mL水楊酸-乙醇溶液(6 mmol/L)，1 mL 過氧化氫溶液(8.8 mmol/L)和1 mL 蒸餾水，混勻，于37 ℃下孵育30 min，測定波長510 nm處的吸光度值。根據式(2)計算羥自由基(·OH)清除率。

(2)

式中：

d——羥自由基清除率，%；

Ai——樣品測定的吸光度值；

Aj——以蒸餾水代替過氧化氫溶液時測定的吸光度值；

A0——以蒸餾水代替樣品時測定的吸光度值。

根據清除率，并參照馮艷萍等[18]報道的方法計算IC50值。

1.8 桑葉多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

參考Masao Hattori等[16]方法并修改如下：移取50 μL不同濃度 (0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/mL)的桑葉總多糖溶液于酶標板中，依次加入 850 μL磷酸鹽緩沖液(0.1 mmol/L，pH 5.0)，50 μLα-葡萄糖苷酶溶液(100 U/mL)，50 μL pNPG溶液(0.011 6 mol/L)混勻。 于37 ℃下恒溫孵育10 min 后，再加入4 mL碳酸鈉溶液(0.1 mol/L)以終止反應，并測定波長400 nm處的吸光度值。根據式(3)計算桑葉總多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率。

(3)

式中：

h——α-葡萄糖苷酶抑制率，%；

Ai——樣品測定的吸光度值；

Aj——以磷酸鹽緩沖液代替α-葡萄糖苷酶溶液時測定的吸光度值；

A0——以磷酸鹽緩沖液代替樣品時測定的吸光度值。

根據抑制率，并參照馮艷萍等[18]報道的方法計算IC50值。

1.9 數據處理與統計分析

所有數據均以3個獨立樣本(n=3)的x±SEM表示。采用SPSS 22.0 軟件進行統計分析，數據進行單因素方差分析后，使用Student's t檢驗進行兩組之間的比較，或者使用進行Duncan檢驗進行多重比較。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 纖維素酶法提取單因素試驗

2.1.1 pH的影響 由圖1可知，當pH<6.0時，多糖得率隨pH增加而顯著增大，并在pH為6.0時達到最大值。但隨著pH值的繼續增加，得率呈下降趨勢。 pH對多糖得率的影響呈單峰函數，可能是由于過高或過低的pH 值會影響酶的活性，在低pH時，過量的酸會水解多糖的糖苷鍵而引起多糖結構破壞，而過高的pH會破壞酶的空間結構，影響底物結合效率。當pH 值在6.0時酶活較強，使得植物細胞壁能夠迅速降解，多糖更易溶出。

2.1.2 酶解溫度的影響 由圖2可知，當酶解溫度低于55 ℃ 時，多糖得率隨溫度的升高而顯著增加，并于55 ℃ 時達到最大。此后隨著溫度的升高，得率呈下降趨勢。酶解溫度對多糖得率的影響呈單峰函數，可能是由于溫度升高時酶促反應加速，但當溫度超過酶的最適溫度時，造成酶活力降低，從而使得率下降。

不同字母表示各組差異顯著，P<0.05圖1 pH對多糖得率的影響Figure 1 Effect of pH on the yield of polysaccharides

不同字母表示各組差異顯著，P<0.05圖2 酶解溫度對多糖得率的影響Figure 2 Effect of temperature on the yield of polysaccharides

2.1.3 酶濃度的影響 由圖3可知，當酶濃度低于2 mg/mL 時，多糖得率隨著酶濃度的增加而顯著增加，而酶濃度超過2 mg/mL后，多糖得率再無顯著變化。這可能是由于隨著酶量的增加，酶與底物接觸機率增大，使得多糖更快地溶出。而當酶濃度升高到一定程度時，酶促反應達到飽和，使得多糖的得率不再增加。

不同字母表示各組差異顯著，P<0.05圖3 酶濃度對多糖得率的影響Figure 3 Effect of enzyme concentration on the yield of polysaccharides

2.1.4 酶解時間的影響 由圖4可知，在多糖提取的初期多糖得率隨著酶解時間的延長而顯著提高，酶解時間的延長有助于細胞壁的溶解和多糖的溶出。當酶解時間為50 min時，多糖得率達到最大。此后隨著酶解時間繼續延長，多糖得率反而顯著下降。這可能是由于已溶出的多糖在反應體系中發生了破壞和降解。

2.2 纖維素酶法提取正交試驗

L9(34)正交試驗因素水平取值見表1，試驗結果見表2。由表2可知，影響多糖得率的因素主次關系為：pH>酶解溫度>酶濃度>酶解時間，最優的組合方式為A2B2C1D3，即：pH 6.0，酶解溫度60 ℃，酶濃度1.0%，酶解時間50 min。采用最優組合進行驗證實驗(n=3)，所得多糖得率為(7.608±0.043)%，說明在最優組合下具有較高的多糖得率。

不同字母表示各組差異顯著，P<0.05圖4 酶解時間對多糖得率的影響Figure 4 Effect of enzymolysis time on the yield of polysaccharides

表1 酶法提取多糖正交試驗因素水平表Table 1 Factors level of enzymatic extraction polysaccharide orthogonal test

表2 L9(34)正交試驗Table 2 L9(34)orthogonal experiment

2.3 桑葉多糖的純化

由圖5可知，洗脫曲線只有一個較大吸收峰，將該吸收峰下糖含量較高的第15～30管洗脫液合并，超濾濃縮并凍干后，即得純化的桑葉總多糖樣品。

雖然通過該方法只能對粗多糖進行純化，并不能將粗多糖中各個組分分離。不過作為食品原料并不需要高純度的單一種類多糖，且該方法簡單快速，不僅多糖的回收率大于80%，同時也能有效地除去色素、蛋白等雜質。

圖5 桑葉多糖凝膠過濾洗脫曲線Figure 5 Gel filtration elution curves of total polysaccharide

2.4 桑葉多糖抗氧化活性比較

通過總抗氧化能力、DPPH 自由基(DPPH·)清除能力和羥自由基(·OH) 清除能力試驗，對純化前后桑葉多糖的抗氧化活性進行比較，從圖6可知，桑葉總多糖在純化前后均具有總抗氧化能力、DPPH·和·OH清除能力，且都與其濃度呈正相關，具有顯著的劑量依賴效應。這可能是由于多糖的抗氧化能力是通過自身氧化提供電子從而實現自由基的清除[17]，多糖濃度越高，所提供的電子數量越多，其抗氧化能力越強。

而在相同濃度下，經純化的桑葉總多糖的總抗氧化能力、DPPH·和·OH清除能力均顯著高于未經純化的(P<0.01)。純化前后桑葉多糖對DPPH自由基清除能力的IC50值分別為 0.54，0.11 mg/mL，純化后提升了約5倍，對·OH清除能力的IC50值分別為24.48，8.19 mg/mL，純化后約為純化前的3倍。由于多糖純度越高其抗氧化活性越強，表明多糖成分在雅津蛋白桑葉抗氧化功能中發揮著主要作用。

2.5 桑葉多糖抑制α-葡萄糖苷酶活性比較

比較純化前后桑葉多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率發現，純化前后桑葉多糖對α-葡萄糖苷酶均有明顯的抑制作用，且濃度越大，抑制率越高，呈劑量依賴效應(圖7)，與季濤等[18]的研究一致。但在相同濃度下，經純化的桑葉總多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率反而顯著低于未經純化的(P<0.01)。通過計算可知純化前后兩者的IC50值分別為 2.70，4.84 mg/mL，純化后其抑制率僅為純化前的0.56倍。

由于桑葉具有顯著的降血糖功能[19]，而α-葡萄糖苷酶作為碳水化合物代謝的關鍵酶[20]，一直是桑葉中降糖功能成分的重要靶點之一[21-22]。已有研究[22]發現桑葉中的黃酮、生物堿類物質也具有抑制α-葡萄糖苷酶的作用，特別是其中的多羥基生物堿1-脫氧野尻霉素(DNJ)已被證明是桑葉降血糖的主要活性成分，具有極強的α-葡萄糖苷酶抑制活性。而純化后的雅津蛋白桑葉多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率反而顯著低于未經純化的，暗示了純化前的雅津蛋白桑葉粗多糖中可能含有黃酮、生物堿等其它具有更強α-葡萄糖苷酶抑制活性雜質，也表明雖然雅津蛋白桑葉總多糖也具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制能力，但卻不是雅津蛋白桑葉中發揮α-葡萄糖苷酶抑制能力的主要成分。

3 結論

采用纖維素酶法提取雅津蛋白桑葉總多糖的最佳工藝條件為：pH 6.0，酶解溫度60 ℃，酶濃度1.0%，酶解時間50 min，在此條件下桑葉多糖的得率可達(7.608±0.043)%。選用 Sephadex G-100型葡聚糖凝膠為填料，以蒸餾水為流動相，進行凝膠層析，以截留分子量3 000 Da的超濾管進行濃縮，可以對雅津蛋白桑葉粗多糖進行純化，滿足其作為功能性食品原料的生產工藝要求。

**表示與純化前相比差異顯著，P<0.01圖6 純化前后桑葉多糖的抗氧化能力Figure 6 Antioxidant capacity of different purity total polysaccharides

**表示與純化后相比差異顯著，P<0.01圖7 純化前后桑葉多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制能力

Figure 7α-glucosidase inhibition rate of different purity mulberry (MorusalbaL.) leavestotal polysaccharides

經過純化的雅津蛋白桑葉總多糖在總抗氧化能力、DPPH·和·OH清除率方面，均顯著高于未經純化的，表明在桑葉中發揮抗氧化功能的主要成分為多糖。而經過純化的桑葉總多糖對a-葡萄糖苷酶的抑制能力要弱于未經純化的，表明多糖并非雅津蛋白桑葉中發揮a-葡萄糖苷酶抑制功能的主要成分。

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