澤瀉總三萜超聲輔助提取工藝優化

石 峰SHI Feng 陳 雨 張亞琴 - 馬留輝 - 竇明明 - 楊正明 - 陳興福 -

(1. 四川農業大學農學院，四川 成都 611130；2. 農業部西南作物生理生態與耕作重點實驗室，四川 成都 611130)

藥材澤瀉為澤瀉科植物澤瀉[Alismaorientalis(Sam.) Juzep.]的塊莖[1]，又名水瀉、芒芋、澤芝、及瀉、如意菜等[2]，在中國福建、四川等地大規模種植，素有“建澤瀉”“川澤瀉”之稱，具有較高的營養價值和藥用價值。2002年3月中國衛生部明確，澤瀉可用作保健食品原料。現代研究[3]表明，澤瀉化學成分主要以萜類為主，含有三萜、二萜、倍半萜、多糖等成分，其中三萜類化合物具有抗血栓、降血脂、降血糖、降低血黏度、抗動脈粥樣硬化、延緩衰老、利尿、解痙、保肝、抗炎、免疫調節等功效。

目前關于植物總三萜的研究較多，主要有熱回流法、超聲輔助提取和超臨界二氧化碳萃取[4-6]等。其中熱回流提取雖然提取率較高，但時間長、能耗高；超臨界二氧化碳萃取操作復雜，且安全性低；而超聲提取既節能效率又高，是很多活性物質提取的新技術[7]。鄧迎娜等[5]采用超聲提取澤瀉總三萜，且優于傳統乙醇回流提取，最大提取率不足2%。本研究在此基礎上增加溫浸輔助提取，采用超聲、溫浸輔助提取澤瀉中總三萜，在單因素試驗基礎上，以澤瀉總三萜提取率為評價指標，利用響應面法進行優化，為深入開發和有效利用澤瀉中總三萜類活性成分提供相應的科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器

超聲波清洗儀：SB 25-12 DTDN型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

電熱鼓風干燥箱：101-3 AB型，天津市泰斯特儀器有限公司；

電子恒溫水浴鍋：DZKW-4型，北京中興偉業儀器有限公司；

酶標儀：Multiskan FC型，上海輔澤商貿有限公司；

精密電子天平：JD 300-3千分之一型，沈陽龍騰電子有限公司；

高速萬能粉碎機：QE-100克型，浙江屹立工貿有限公司。

1.2 材料與試劑

澤瀉：采自四川省眉山市彭山區謝家鎮紅石村，經四川農業大學陳興福教授鑒定為澤瀉科植物澤瀉[Alismaorientalis(Sam.) Juzep.]的塊莖，經干燥、粉碎并過60目篩，備用；

23-乙酰澤瀉醇B對照品：批號PS15031701，純度≥98%，成都普思生物科技股份有限公司；

無水乙醇、香草醛、冰乙酸、高氯酸等：分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 澤瀉總三萜的提取 準確稱取澤瀉干燥塊莖粉末1.0 g，按照試驗方案加入一定量的一定體積分數乙醇，在一定溫度下浸提一定時間，并超聲提取一定時間，過濾，取濾液稀釋一定濃度于試管中，作為待測液。

1.3.2 澤瀉總三萜含量與提取率的測定

(1) 對照品溶液的制備：精密稱取23-乙酰澤瀉醇B對照品1.26 mg，于25 mL容量瓶中，加乙醇適量溶解，搖勻，定容，得到濃度為0.050 4 mg/mL的23-乙酰澤瀉醇B對照品溶液，待用。

(2) 樣品溶液的制備：精密量取1.3.1項下待測液0.2 mL，用相應體積分數的乙醇稀釋至1 mL，搖勻，即得樣品溶液。

(3) 測定波長的確定：分別取對照品溶液和樣品溶液，按照1.3.2(4)項下顯色方法顯色，于400～600 nm波長之間掃描，結果表明，兩者均在555 nm波長處有最大吸收，故選擇555 nm為檢測波長。

(4) 標準曲線的繪制：精密吸取對照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL于10 mL的試管中，在60 ℃水中把溶劑揮干，揮干后于試管中加入0.2 mL 的5%香草醛-冰乙酸溶液，0.8 mL高氯酸，60 ℃水浴15 min，冷卻5 min，加冰醋酸5.0 mL，搖勻，測定波長為555 nm[8]。橫坐標為23-乙酰澤瀉醇B含量，縱坐標為吸光度，得到標準曲線：Y=8.496X+0.000 1，相關系數R2=0.999 4，表明吸光度與質量線性關系良好。

(5) 樣品含量測定：取1.3.2(2)項下樣品溶液0.2 mL，按照1.3.2(4)項下方法顯色，在555 nm波長處測定吸光度，根據標準曲線的回歸方程計算，得樣品總三萜含量，按式(1)計算提取率。

(1)

式中：

c——總三萜提取率，%；

m1——總三萜含量，g；

m2——澤瀉原料重，g。

1.3.3 單因素試驗

(1) 乙醇體積分數對澤瀉總三萜提取率的影響：準確稱取澤瀉干燥塊莖粉末1.0 g于50 mL離心管中，分別加入40%，50%，60%，70%，80%，90%乙醇16 mL，置50 ℃恒溫水浴鍋浸提45 min，超聲30 min，測定總三萜含量，3次平行試驗取平均值，計算總三萜提取率。

(2) 料液比對澤瀉總三萜提取率的影響：準確稱取澤瀉干燥塊莖粉末1.0 g于50 mL離心管中，分別加入80%乙醇8，10，12，14，16 mL，置50 ℃恒溫水浴鍋中浸提45 min，超聲30 min，測定總三萜含量，3次平行試驗取平均值，計算總三萜提取率。

(3) 超聲時間對澤瀉總三萜提取率的影響：準確稱取澤瀉干燥塊莖粉末1.0 g于50 mL離心管中，加入80%乙醇12 mL，置50 ℃恒溫水浴鍋浸提45 min，超聲10，20，30，40，50 min，測定總三萜含量，3次平行試驗取平均值，計算總三萜提取率。

(4) 浸提時間對澤瀉總三萜提取率的影響：準確稱取澤瀉干燥塊莖粉末1.0 g于50 mL離心管中，加入80%乙醇12 mL，置50 ℃恒溫水浴鍋浸提15，25，35，45，55 min，超聲30 min，測定總三萜含量，3次平行試驗取平均值，計算總三萜提取率。

(5) 浸提溫度對澤瀉總三萜提取率的影響：準確稱取澤瀉干燥塊莖粉末1.0 g于50 mL離心管，加入80%乙醇12 mL，分別在30，40，50，60，70 ℃恒溫水浴鍋中，浸提45 min，超聲30 min，測定總三萜含量，3次平行試驗取平均值，計算總三萜提取率。

1.3.4 響應面試驗設計 根據單因素試驗結果，采用浸提時間、乙醇體積分數、浸提溫度和料液比為試驗因素，建立四因素三水平的Box-Behnken響應面試驗設計，以總三萜提取率為響應值。

1.4 數據處理

運用Excel和Design-Expert 8.0.7.1 軟件程序，利用響應面分析法對試驗數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分數對總三萜提取率的影響 由圖1可知，在乙醇體積分數80%以內，澤瀉總三萜的提取率逐漸增加；當乙醇體積分數為80%時，總三萜提取率有峰值。乙醇體積分數超過80%，隨著乙醇體積分數進一步增加，總三萜提取率反而降低，可能是三萜類化合物是弱極性物質，隨著乙醇體積分數的繼續增加，溶劑極性越弱，導致三萜類化合物的溶解度降低，總三萜提取率下降[5]。因此，確定最佳的乙醇體積分數為80%。

2.1.2 料液比對總三萜提取率的影響 由圖2可知，隨著溶劑用量的增加，總三萜的提取率也逐漸增加。當料液比達到1∶12 (g/mL)以后，提取率呈現微弱的下降趨勢，可能是總三萜含量在1∶12 (g/mL)左右達到峰值，隨著溶劑量的繼續增大，反而起到稀釋的效果。為節約成本，綜合考慮選擇1∶12 (g/mL)為適宜的料液比。

圖2 料液比對澤瀉總三萜提取率的影響Figure 2 Effect of solid-liquid ratio on yield of the total triterpenoid

2.1.3 超聲時間對總三萜提取率的影響 由圖3可知，總三萜的提取率隨著超聲時間的延長而增大，30 min后提取率反而緩慢下降，可能是三萜類化合物的結構穩定性對超聲比較敏感，長時間在較強的機械剪切、振動作用下，其結構可能會發生改變[9]，從而降低提取率。因此，綜合考慮能源消耗和生產效率，選擇超聲提取時間為30 min。

圖3 超聲時間對澤瀉總三萜提取率的影響Figure 3 Effect of ultrasonic time on yield of the total triterpenoid

2.1.4 浸提時間對總三萜提取率的影響 由圖4可知，樣品在溶劑中浸提，隨著時間的延長，提取率呈上升趨勢。當時間為45 min時，提取率出現峰值，隨著浸提時間的延長，提取率反而下降，可能是在一定溫度下，三萜類化合物長時間在提取劑中其結構穩定性減弱。因此，選擇45 min 為較適宜的浸提時間。

2.1.5 浸提溫度對總三萜提取率的影響 由圖5可知，浸提溫度在60 ℃以內時，提取率隨之增加。在60 ℃時，提取率出現峰值，溫度繼續升高，提取率反而下降。可能是三萜類化合物對溫度比較敏感，當溫度升高到一定程度以后，長時間受熱導致其結構變化或降解，導致提取率下降[10-11]。因此，選取60 ℃為最佳浸提溫度。

圖4 浸提時間對澤瀉總三萜提取率的影響Figure 4 Effect of extraction time on yield of the total triterpenoid

圖5 浸提溫度對澤瀉總三萜提取率的影響Figure 5 Effect of extraction temperature on yield of the total triterpenoid

2.2 響應面法優化提取工藝

在單因素試驗基礎上，應用四因素三水平的中心組合試驗設計，以4個因素作為自變量，總三萜提取率為因變量，優選澤瀉總三萜的提取條件。試驗因素水平見表1。試驗設計與結果見表2。

2.3 響應面工藝優化分析

將所得數據采用Design-Expert 8.0.7.1 軟件來統計分析，得到總三萜提取率與提取條件的回歸方程為：

R=3.06-0.097×A-0.040×B+0.083×C-0.015×D-0.11×AB+0.12×AC+0.096×AD+0.027×BC+3.972E-003×BD+0.14×CD-0.080×A2-0.28×B2-0.10×C2-0.39×D2。

(2)

由表3可知，選用模型P<0.000 1，F=38.62，說明具有統計學意義，該二次回歸方程模型極顯著。失擬項不顯著(P=0.451 9>0.05)，模型R2為0.974 8，adj-R2為0.949 5，表明回歸方程擬合度良好，可以用來優化和預測總三萜最佳提取工藝條件。根據回歸系數的顯著性檢驗可知，一次項A、B、C均對總三萜提取率的影響達到顯著效應，交互項AB、AC、AD、CD對提取率的交互影響顯著，二次項A2、B2、C2、D2對提取率的影響達到顯著效應。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and coded levels in the central composite design

由圖6(a)可知，在浸提溫度和料液比一定條件下，隨著乙醇體積分數的升高，響應值呈緩慢下降趨勢，隨著浸提時間的增加，響應值先升高后下降，當乙醇體積分數約至70%、浸提時間約至45 min，響應值存在極大值。由圖6(b)可知，在浸提時間、料液比一定條件下，乙醇體積分數響應曲面較陡峭，說明2個提取條件對總三萜的提取率有較顯著的交互影響，當乙醇濃度約為70%、浸提溫度約至60 ℃，響應值達最大。由圖6(c)可知，在浸提時間和浸提溫度一定條件下，隨著料液比的增加，響應值先升高后降低，當乙醇體積分數約為70%、料液比約至1∶14 (g/mL)，響應值最大。由圖6(d)可知，在乙醇體積分數、浸提時間一定條件下，料液比響應曲面較陡峭，說明料液比與浸提溫度對提取率具有較顯著交互影響，當料液比約至1∶14 (g/mL)、浸提溫度約至60 ℃，響應值最大。綜上可得，該模型有穩定點，且穩定點是最大值。

表2 試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface experiment

表3 回歸分析?Table 3 The results of regression analysis

? **表示差異極顯著，P<0.01；*表示差異顯著，P<0.05。

圖6 各因素兩兩交互作用對總三萜提取率影響的響應面圖Figure 6 Various factors on the impact of interaction on the yield of total triterpenoid

2.4 驗證實驗

根據上述分析研究，得到最佳提取條件：浸提溫度57.10 ℃，乙醇體積分數70.00%，浸提時間46.06 min，料液比1∶13.61 (g/mL)，超聲時間30 min，該條件下總三萜提取率為3.09%。

為了驗證響應面優化結果的可靠性，以及可操作性，將提取條件修正為乙醇體積分數70%，浸提時間46 min，浸提溫度57 ℃，料液比1∶14 (g/mL)，超聲時間30 min。按上述條件進行3次平行驗證實驗，得澤瀉總三萜平均提取率為2.98%，與理論預測值基本一致，相對偏差為3.62%。

3 結論

本試驗最終確定澤瀉總三萜最佳提取工藝為：乙醇體積分數70%、浸提時間46 min，浸提溫度57 ℃、料液比1∶14 (g/mL)，超聲時間30 min，在此條件下總三萜得率為2.98%。

本研究與傳統的乙醇回流提取、超臨界二氧化碳萃取相比，超聲提取能顯著提高總三萜提取率，經濟有效，同時增加了溫度浸提對提取率的影響，更加全面地闡述了試驗因素對提取率的影響。不足之處是在超聲提取時采取人工控溫，可能存在誤差，若測定時采用高效液相色譜法，結果可能更精確。

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