大米肽中壓離子交換色譜分離及其免疫活性評價

程云輝G Yun-hui 毛田米 - 黃 璐 陳茂龍 - 文 李 許 宙

(長沙理工大學化學與生物工程學院，湖南 長沙 410114)

基于酶法降解食源性蛋白質并結合分離純化技術從酶解肽混合物中獲得活性肽一直被當作篩選食源性活性肽的經典方法[1]，本課題組[2]前期已基于蛋白質酶解物疏水性的差異，通過DA201-C型大孔吸附樹脂從大米蛋白質胰酶(Trypsin)酶解物中分離出具有較強免疫活性的RPHs-A3(Rice protein hydrolysates-40% ethanol fraction)組分；為進一步提高RPHs-A3組分的純度和免疫活性，擬基于RPHs-A3組分帶電性的差異，繼續采用離子交換色譜對其進行分離純化。

中壓液相色譜壓力范圍為0.5～2.0 MPa，其壓力介于低壓與高壓液相色譜之間。與低壓柱色譜相比，具有分辨率高、分離速度快、可梯度洗脫等優勢；與高壓液相色譜相比，盡管在穩流、精度、檢測靈敏度方面還有差距，但其制備量大、可自主填充分離柱填料而提高分離選擇性等特點，使其成為近年來備受關注的活性肽分離純化新方法[3-4]。WorkBeads 40 Q是一種以季氨基為官能團的強陰離子交換劑，具有載量高、重復性與化學穩定性好等特點，在實驗室或工業規模分離純化蛋白質、多肽和核酸等領域具有良好的應用前景。

本研究擬以小鼠巨噬細胞RAW264.7 MTT增殖試驗SI值和脂多糖(LPS)炎癥模型NO釋放量為雙考察指標，利用WorkBeads 40 Q對RPHs-A3組分進行分離純化，在考察不同分離條件對大米免疫活性肽分離效果影響的基礎上，確定中壓離子交換色譜分離RPHs-A3的最佳條件，并進一步提高RPHs-A3組分的純度和免疫活性，為中壓離子交換色譜技術在活性肽分離純化中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

大米蛋白：堿提酸沉法提取；

胰蛋白酶：合肥博美生物科技有限公司；

二甲基亞砜(DMSO)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)：上海生物工程有限公司；

DMEM培養基：美國HyClone公司；

胎牛血清(FBS)：美國Gibco公司；

小鼠巨噬細胞(RAW264.7)：江蘇省原子醫學研究所；

Work Beads 40 Q：杭州開泰生物技術有限公司；

氯化鈉、無水乙醇、氫氧化鈉、Tris、鹽酸：分析純試劑，上海國藥集團有限公司；

其他試劑：分析純。

1.1.2 主要儀器設備

臺式pH計：DELTA320型，江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；

可見分光光度計：22PC型，上海棱光技術有限公司；

玻璃層析柱：2.6 cm×40 cm色譜柱，利穗科技有限公司；

全自動蛋白質純化系統：APPS MV 100D型，利穗科技有限公司；

酶標分析儀：DNM-9602型，北京普朗新技術有限公司；

恒溫培養箱：DNP-9052型，蘇州威爾實驗用品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大米活性肽RPHs-A3組分的制備工藝流程

一定底物濃度大米蛋白懸浮液→調pH值→一定溫度下超級恒溫水浴酶反應器中溶解30 min→按不同底物濃度、加酶量、pH值、溫度進行酶解(pH-stat法使體系pH穩定)→滅酶(85 ℃，15 min)→離心(3 500 r/min，15 min)→上清液→真空濃縮(終體積為5～10 mL)→冷凍干燥(-45 ℃，30 Pa 以下，40 h)→大米蛋白酶解物RPHs→DA201-C型大孔吸附樹脂吸附、脫鹽→40%乙醇洗脫→RPHs-A3組分[5]

1.2.2 中壓離子交換色譜分離方法

(1) 離子交換劑的選擇：采用強陰離子交換樹脂WorkBeads 40 Q對RPHs-A3組分進行分離純化。前期研究確定RPHs-A3組分的等電點范圍為pH 2.25～3.50，因此使RPHs-A3組分帶負電的pH范圍為pH>3.50，又因WorkBeads 40 Q的pH穩定范圍為2～13，故選擇WorkBeads 40 Q對RPHs-A3組分進行分離純化。

(2) 起始緩沖液pH的選擇：采用試管小試法[6]98-99確定緩沖液起始pH。首先分別配制0.50，0.01 mol/L的不同pH的緩沖液，pH以1.0為梯度，從2.0增至11.0。取10 mL的試管，每管加入1.5 mL樹脂，然后依次在每支試管中加入0.5 mol/L的不同的緩沖液10 mL，混合一段時間后棄去上清液，如此反復洗滌10次。再換用0.01 mol/L的緩沖溶液，每次10 mL反復洗滌5次[7]。向洗滌好的樹脂中分別加入等量濃度相同的大米免疫活性肽溶液，充分混合后，放置5～10 min后，測定上清液中未被吸附的蛋白含量。

(3) 中壓離子交換色譜分離RPHs-A3組分的條件：將處理好的Work Beads 40 Q樹脂填充到2.6 cm×40 cm規格的玻璃柱中，用0.01 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 9.0)以10 mL/min的速度平衡層析柱3～4 BV；用平衡緩沖液配制濃度為30 mg/mL的大米免疫活性肽溶液，上樣量5 mL，上樣流速0.5 mL/min；上樣結束后，用平衡緩沖液以10 mL/min 的流速進行洗脫，在220 nm波長下檢測洗脫液吸光值，收集穿透峰；然后用0.0～0.5 mol/L的NaCl進行梯度洗脫，收集洗脫峰；對各組分進行脫鹽后濃縮干燥，得到不同分離組分。

1.2.3 RPHs-A3分離組分免疫活性的測定

(1) 小鼠巨噬細胞增殖試驗：采用MTT法，取對數期的RAW264.7細胞，細胞濃度為7×105個/mL、100 μL并接種于96孔板中，在37 ℃、5% CO2的培養箱中孵育4 h后，加入大米免疫活性肽，空白對照組加等量的無菌水，陽性對照組加等量IgG，繼續在培養箱中孵育20 h；在終止孵育前4 h加入20 μL MTT(5 mg/L)；棄掉每孔中的液體，向孔中加入150 μL二甲基亞砜，避光條件下輕震5 min[8]，采用酶標儀在492 nm檢測吸光度(OD值)，并按式(1)計算SI值。

(1)

式中：

SI——細胞增殖指數；

OD1——試驗組OD值；

OD2——對照組OD值。

(2) 小鼠巨噬細胞RAW264.7的NO釋放量的測定：當培養皿中的細胞生長至對數期時，棄去細胞培養基上清，用移液槍吸取無菌PBS將細胞輕輕吹下，離心收集細胞，96孔培養板中接種3×104個/孔的細胞，每孔200 μL細胞液，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養過夜，待細胞貼壁后，以3復孔為一組，分為對照組、LPS炎癥模型組、RPHs-A3和RPHs-A3-B(1～5)預處理組，根據文獻[9]修改如下：

① 對照組：均加入含10% FBS的DΜEM培養基；

② 炎癥模型組：加入含10% FBS的DΜEM培養基，培養12 h，再加入用DΜEM培養基稀釋的LPS溶液，培養24 h；

③ RPHs-A3和RPHs-A3-B(1～5)預處理組：加入用DΜEM培養基稀釋的RPHs-A3和RPHs-A3-B(1～5)溶液，使RPHs-A3和RPHs-A3-B(1～5)的終濃度均為50 μg/mL，陽性對照組加等量IgG，培養12 h，加入用DΜEM培養基稀釋的LPS溶液，培養24 h。

收集細胞培養基上清，于4 ℃、12 000×g低溫離心5 min 以去除細胞雜質等。用GRIESS法檢測上清中的NO含量。并按式(2)計算NO抑制率。

(2)

式中：

IR——NO抑制率；

c1——LPS刺激產生NO濃度；

c2——RPHs-A3-B(1～5)預處理后產生NO濃度。

2 結果與討論

2.1 中壓離子交換色譜分離條件的優化

2.1.1 試管小試法確定緩沖液起始pH 緩沖液起始pH值的選擇對離子交換色譜吸附特性很關鍵[10]，緩沖液起始pH決定了RPHs-A3組分及WorkBeads 40 Q的帶電狀態，確保WorkBeads 40 Q帶充足電荷的同時決定了RPHs-A3組分帶電荷的種類和數量，是RPHs-A3組分是否發生吸附的重要參數[6]86。本研究考察了在不同緩沖液起始pH下WorkBeads 40 Q對RPHs-A3組分的吸附效果，結果見表1。由表1可知，起始pH對RPHs-A3組分吸附效果影響較大，在pH為9.0的條件下，上清液中RPHs-A3組分的含量最低，為2.01 mg/mL，說明在此pH條件下RPHs-A3組分在WorkBeads 40 Q樹脂上的吸附量最大，因此確定pH 9.0為最佳起始pH。

表1不同起始pH下WorkBeads 40 Q對RPHs-A3的吸附?

Table 1 The Adsorption of RPHs-A3 by WorkBeads 40 Q at different initial pH

起始pH含量/(mg·mL-1)起始pH含量/(mg·mL-1)2.05.657.04.903.05.488.04.164.05.449.02.015.05.1710.02.716.05.4111.03.11

? 上樣濃度5 mg/mL。

2.1.2 離子強度變化方式對RPHs-A3組分分離效果的影響

WorkBeads 40 Q強陰離子層析柱的分離原理是基于溶質分子所帶電荷性質和電荷量的不同而使其在層析柱中移動速度不同來實現分離的[11]。本研究探索了不同離子強度變化方式對WorkBeads 40 Q分離純化RPHs-A3組分的影響，以確定最佳分離條件。選擇起始緩沖液為pH 9.0、0.01 mol/L 的Tris-HCl緩沖液，極限緩沖液為含0.5 mol/L NaCl的pH 9.0、0.01 mol/L的Tris-HCl緩沖液，通過中壓液相色譜將2種緩沖液按一定比例混合，可以得到NaCl濃度在0.0～0.5 mol/L連續變化的離子強度梯度。圖1為采用梯度洗脫方式分離RPHs-A3組分的圖譜，由圖1可知，隨著離子強度的增大，RPHs-A3組分依次被分為5個組分，選擇性差導致分辨率較低，分離效果較差；圖2為采用階段洗脫方式分離RPHs-A3組分的圖譜，由圖2可知，階段洗脫方式對RPHs-A3組分的分離效果較好，選擇性好，分辨率較高。RPHs-A3組分在不同的離子強度下依次被分為5個組分，穿透峰RPHs-A3-B1為未被吸附的部分，組分RPHs-A3-B2、RPHs-A3-B3、RPHs-A3-B4、RPHs-A3-B5依次為含0.05，0.10，0.20，0.30 mol/L NaCl的pH 9.0，0.01 mol/L的Tris-HCl緩沖液從離子交換劑上洗脫下來的組分。由于起始緩沖液的離子強度較低，RPHs-A3組分與WorkBeads 40 Q上季氨基之間結合能力更強，能取代緩沖液離子而吸附到WorkBeads 40 Q上。但隨著離子強度增大，緩沖液離子會與RPHs-A3組分競爭結合WorkBeads 40 Q，從而減弱了RPHs-A3組分與WorkBeads 40 Q之間的靜電作用力，首先使一些帶凈電荷較少、吸附得不太牢固的活性肽解吸而被洗脫下來；繼續增大離子強度，使結合得更為牢固的一些活性肽被洗脫，各個組分將在特定離子強度的緩沖液中被洗脫下來，從而實現分離[12]。比較圖1和圖2可知，階段洗脫分離RPHs-A3組分的效果要優于梯度洗脫。由于梯度洗脫的離子強度是連續增加的，洗脫峰也連續被洗脫下來，選擇性較差導致分辨率降低；階段洗脫的離子強度是逐級增加的，各級洗脫峰相距較遠，分辨率提高。本研究后續將選擇階段洗脫方式對大米免疫活性肽RPHs-A3組分進行分離純化。

色譜柱尺寸為2.6 cm×40 cm；離子交換劑為WorkBeads 40 Q；樣品為5 mL、20 mg/mL RPHs-A3組分；平衡緩沖液A為pH 9.0，0.01 mol/L Tris-HCl；洗脫緩沖液B為含1 mol/L NaCl的pH 9.0，0.01 mol/L Tris-HCl；上樣流速1 mL/min；洗脫流速10 mL/min

圖1 離子強度線性洗脫分離RPHs-A3組分圖譜

Figure 1 The separation of fraction RPHs-A3 by linear elution of different ionic strength

色譜柱尺寸為2.6 cm×40 cm；離子交換劑為WorkBeads 40 Q；樣品為5 mL、30 mg/mL RPHs-A3組分；平衡緩沖液A為：pH 9.0，0.01 mol/L Tris-HCl；洗脫緩沖液B為含1 mol/L NaCl的pH 9.0，0.01 mol/L Tris-HCl；上樣流速1 mL/min；洗脫流速10 mL/min

圖2 離子強度階段洗脫分離RPHs-A3組分圖譜

Figure 2 The separation of fraction RPHs-A3 by stage elution of different ionic strength

2.1.3 上樣量對RPHs-A3組分分離效果的影響 本研究探索了上樣量對分離效果的影響，在不同上樣量條件下WorkBeads 40 Q對RPHs-A3組分的分離效果見圖3。由圖3可知，隨著上樣量的增加，分離效果逐漸變差，分辨率降低，其原因是上樣量過大超出了WorkBeads 40 Q的有效交換容量。兼顧考慮分離效率，在保證分離效果的前提下通常會選擇大的上樣量，故以30 mg/mL、5 mL為最佳上樣量。本研究選用WorkBeads 40 Q強陰離子交換樹脂、2.6 cm×40 cm色譜柱對RPHs-A3組分進行分離的較佳條件確定為：上樣濃度30 mg/mL，上樣量5 mL，平衡緩沖液A為pH 9.0的0.01 mol/L Tris-HCl，洗脫緩沖液B為含1 mol/L NaCl的pH 9.0、0.01 mol/L Tris-HCl，上樣、洗脫流速分別為1，10 mL/min。

色譜柱尺寸為2.6 cm×40 cm；離子交換劑為WorkBeads 40 Q；樣品為5 mL不同濃度的RPHs-A3組分；平衡緩沖液A為：pH 9.0，0.01 mol/L Tris-HCl；洗脫緩沖液B為含1 mol/L NaCl的pH 9.0，0.01 mol/L Tris-HCl；上樣流速1 mL/min；洗脫流速10 mL/min

圖3 不同上樣量條件下RPHs-A3組分分離圖譜

Figure 3 The separation of fraction RPHs-A3 under different loading conditions

2.2 中壓離子交換色譜分離組分免疫活性的研究

本研究分別以小鼠巨噬細胞RAW264.7 MTT增殖試驗SI值和脂多糖(LPS)炎癥模型細胞內NO釋放量為考察指標，考察了中壓離子交換色譜各分離組分的免疫活性，結果見圖4、5。

*與對照相比，P<0.05；**與RPHs相比，P<0.01；B1、B2、B3、B4、B5分別對應RPHs-A3-B1、RPHs-A3-B2、RPHs-A3-B3、RPHs-A3-B4、RPHs-A3-B5，A3對應RPHs-A3

圖4 RPHs-A3-B(1～5)對小鼠巨噬細胞RAW264.7增殖活性的影響

Figure 4 The effect of fractions RPHs-A3-B(1～5) on proliferation of Murine Macrophage RAW264.7

##與對照相比，P<0.01；*與炎癥組相比，P<0.05；**與炎癥組相比，P<0.01;B1、B2、B3、B4、B5分別對應RPHs-A3-B1、RPHs-A3-B2、RPHs-A3-B3、RPHs-A3-B4、RPHs-A3-B5，A3對應RPHs-A3

圖5 RPHs-A3-B(1～5)對脂多糖(LPS)炎癥模型NO釋放的影響

Figure 5 The effect of fractions RPHs-A3-B (1～5) on intracellular NO release inlipopolysaccharide (LPS) inflammation model

從圖4可知，組分RPHs-A3-B2、RPHs-A3-B3、RPHs-A3-B5對RAW264.7細胞皆具有較好的增殖作用，其SI值分別為1.152，1.315，1.206，與RPHs-A3組分(SI值為1.273)相比，RPHs-A3-B3組分的SI值顯著提高(P<0.05)。

由圖5可知，50.00 μg/mL的各分離組分對NO釋放的抑制效果有著明顯差異，RPHs-A3-B4對NO釋放無抑制作用；RPHs-A3-B1、RPHs-A3-B2和RPHs-A3-B5 3個組分對NO釋放有抑制作用，但效果不顯著；而RPHs-A3-B3組分則對NO釋放具有顯著抑制作用(P<0.05)，NO濃度可由LPS刺激的(7.605±0.000) μmol降至(6.975±0.008) μmol(P<0.05)，抑制率為8.28%。MTT試驗活性檢測結果和炎癥模型活性檢測結果皆表明中壓離子交換色譜分離純化獲得的免疫活性最佳組分為RPHs-A3-B3，后續研究擬將采用低壓凝膠過濾色譜繼續對其進行分離純化。

3 結論

中壓色譜是對常壓色譜的延續與發展，具有分辨率高、分離速度快、可梯度洗脫、制備量大、可自主填充分離柱填料等優點。目前多用于天然產物的分離純化，在生物活性肽領域里的應用較少，還有待進一步的研究。本研究表明中壓離子交換色譜能顯著提高大米免疫活性肽RPHs-A3組分的免疫活性，使其SI值從1.273提高到1.315(P<0.05)，且對細胞內NO釋放的抑制率為8.28%(P<0.05)。本研究不僅得出了中壓離子交換色譜分離純化大米免疫活性肽RPHs-A3組分的最佳條件，同時也為中壓離子交換色譜技術在活性肽分離純化中的應用提供了理論依據。

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