菌落總數測試卡用凝膠培養基和顯色劑的優化

郭登峰GUO Deng- 王羚佳 - 舒曉夢 - 楊 瀟 張 偉 張廣峰 -

(1. 西華大學食品與生物工程學院，四川 成都 610039；2. 成都瑞琦科技實業股份有限公司，四川 成都 610041)

菌落總數是反映食品被微生物污染狀況和新鮮程度的重要指標[1]。目前菌落總數快速檢測方法包括顯色培養基法、ATP 生物熒光法、微熱量法、阻抗法、近紅外光譜技術和快速檢測卡片法等[2-4]?？焖贆z測卡片(下文統一稱為檢測卡)與傳統的微生物培養平板檢測相比，因其省略了培養基制作、消毒環節，使得勞動強度大幅減輕；還具有體積小、便于攜帶儲存、檢測周期短、操作簡便等優點[5-6]，從而被運用于快速檢測的領域，極大地簡化了對微生物總數檢測的程序。

從1955年德國學者FJ. Forg發明了快速檢測大腸菌群的紙片法以來[7]，檢測卡已經得到了長足的發展。目前菌落檢測卡主要分為濾紙、無紡布和冷水溶性凝膠3種類型[8]。其中濾紙和無紡布雖然成本低廉，但是由于孔隙大，保水性差，不利于菌體生長，導致菌落計數不準確。與前兩者相比，冷水溶性凝膠卻有著穩定性好、透明度高、易挑菌、菌落計數準確等優點[9-10][11]9-14。而在國內外應用最為廣泛的是美國3M公司的PetrifilmTM菌落總數檢測卡，由于具有較高的可靠性，曾被納入中國國家標準[12]，但是昂貴的價格，也限制了其在中國一般實驗室和企業的大規模使用。因此研究具有自主知識產權的冷水溶性凝膠菌落檢測卡片，對于降低檢測卡的使用成本，促進微生物指標檢測的廣泛開展，提升食品安全具有重要意義。

本研究主要通過對常見的冷水溶性凝膠劑[卡拉膠、黃原膠、瓜爾膠、刺槐豆角、聚丙烯酸鈉、羧甲基纖維素(CMC)]進行篩選組合、探索凝膠劑配方及其與培養基混合比例、優化顯色劑的添加量等來提升水冷凝膠測試卡的使用性能，為新型菌落總數檢測卡的研發提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)：AR級，上海馨晟試化工科技有限公司；

胰蛋白胨、酵母提取物：AR級，西班牙OXOID公司；

氯化鈉、瓜爾膠、卡拉膠、黃原膠、CMC、聚丙烯酸鈉：AR級，成都科龍化工試劑廠；

乙醇：AR級，國藥集團化學試劑有限公司；

全自動高溫蒸汽滅菌鍋：G154DWS型，致微(廈門)儀器有限公司；

電熱恒溫隔水式培養箱：SGSP-02型，黃石市恒豐醫療器械有限公司；

混合型球磨儀：MM400型，德國RETSCH(萊馳)公司；

萬分之一電子天平：TB-214型，美國DENVER INSTRUMENT(丹佛儀器)公司；

紫外可見分光光度計：UV2400型，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；

pH儀：MP511型，上海三信公司；

質構儀：TA·XT2i型，英國SMS公司。

1.2 試驗菌種

大腸桿菌(LE392)、岅崎腸桿菌(ATCC51329)、福氏志賀菌(CMCC51252)、金黃色葡萄球菌(ASI1861)、沙門菌(ASI1859)、銅綠假單胞菌(CICC10204)、糞鏈球菌(CMCC32220)：西華大大學食品安全實驗室保存。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化與菌懸液的制備 將各菌種分別于LB培養基中震蕩培養2 h活化，并涂布于LB平板上并于37 ℃倒置培養12 h，挑取單菌落轉入LB液體培養基中繼續培養4 h，將各菌種菌液等比例混合后稀釋103倍，待用。

1.3.2 測試卡凝膠培養基粉的制備 LB培養基(胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g充分混合)與凝膠粉按一定比例充分混合后，經超微粉碎1 min，并用紫外線進行殺菌待用。

1.3.3 測試片法 將制備好的測試卡凝膠培養基粉黏附在上下層透明塑料卡上。吸取1 mL 新鮮制備的菌液，翻開測試片上層，均勻滴于測試片中央，小心蓋上上層膜，輕輕壓平使樣液充滿測試片，靜置5 min，待凝膠固化后于37 ℃培養24 h，計數紅色菌落[13-14]。

1.3.4 凝膠的吸水率、保水率測定 稱取1.00 g膠粉置于燒杯中，加入500.00 g蒸餾水混勻，放置5 min使其充分溶脹成膠，用100目篩過濾，精密稱定濾液重量。吸水率按式(1)計算：

(1)

式中：

A——吸水率，%；

M1——加入蒸餾水質量，g；

M2——濾出蒸餾水質量，g；

M0——稱取的凝膠粉水質量，g。

稱取1.00 g膠粉置于潔凈燒杯中，加入500.00 g蒸餾水混勻，放置5 min使其充分溶脹成膠，棄去多余水分，再精密稱取凝膠重量，將其置于37 ℃恒溫培養箱中，分別放置8，24 h 后精密稱定重量。按式(2)計算保水率。

(2)

式中：

C——保水率，%；

M1——放置不同時間后的凝膠質量，g；

M0——溶脹成凝膠后的質量，g。

1.3.5 水擴散速度與成膠性評價 在透明塑料卡上繪制一個直徑10 cm的圓，將成膠劑黏附在透明塑料卡上，向圓心滴入1 mL的蒸餾水并開始計時，水擴散至圓形邊緣時停止計時，滴入水后靜置5 min，觀察是否凝固形成凝膠。

1.3.6 凝膠物性分析 凝膠劑制成厚度為15 mm的凝膠，按照ISO 9665方法測試膠體物性。即在質構儀上選用P/0.5R柱狀探頭，以壓縮模式檢測，測前速度1.0 mm/s，測試速度1.0 mm/s，測后速度1.0 mm/s，刺入深度10 mm，數據采集速率400 pps；觸發力 2 g。以刺入過程中測得的最大力量為凝膠強度，以達到最大力量時的刺入距離表征凝膠彈性。在穿刺中力量和距離越大，表明凝膠越有韌性和彈性。

1.3.7 凝膠劑組成優化 將根據吸水率、保水率及成膠情況優選出的凝膠進行兩兩組合，評價其水擴散速度和成膠性。選擇擴散速度和成膠性好的凝膠組合，并進一步進行物性比較，以篩選出最優的凝膠劑組成。

1.3.8 凝膠與培養基的比例優化 將優化過的混合凝膠粉與培養基分別按1∶1，1∶2，2∶1的質量比混勻，加入蒸餾水制凝膠，在37 ℃下培養0，12，24 h后，參考吳許文[11]33的方法測定其pH，在37 ℃下培養24 h后測定凝膠物性，并參考吳許文[11]35的方法在500 nm下測其透光度。 選擇可在37 ℃ 恒溫條件下pH穩定、凝膠強度合適、透光率好、可穩定凝固、成膠無氣泡無褶皺黏附，菌落生長正常、分布均勻、清晰可辨的培養基凝膠組合。

1.3.9 TTC加入量的優化 根據相關文獻[15-17]，TTC在培養基中濃度超過0.100 mg/mL時抑菌較明顯，低于0.020 mg/mL 時顯色作用不明顯。因此選擇TTC實際濃度0.020，0.025，0.030，0.035，0.040 mg/mL進行TTC加入量優化。試驗中，先配制濃度為0.040，0.050，0.060，0.070，0.080 mg/mL 的TTC溶液，滅菌后分別與稀釋105倍的菌液按1∶1體積比混合后，接種于測試卡上并于37 ℃培養24 h 后計數觀察。選擇顯色明顯、易于計數且對微生物無抑制作用的TTC濃度。

1.3.10 測試卡片法與傾注培養法對比 將混合菌液依次稀釋103，104，105，106倍，分別采用測試卡片法與傾注培養法(按GB/T 4789.2—2016執行)進行檢測，比較二者菌落總數的檢測結果。

2 結果與討論

2.1 冷水溶凝膠的基本性能

凝膠吸水率與保水率的優良將直接影響到測試卡的測試效果。吸水率優良的凝膠可以使水快速地在測試卡上擴散，不僅縮短操作時間，還能保證菌落擴散均勻[18]。保水率優良的凝膠將有效地保持測試卡上的水分不流失蒸發，從而為測試卡上的微生物提供一個穩定合適的生長環境。

從凝膠劑吸水率和保水率試驗結果可知(表1)，各凝膠吸水率大小順序為：聚丙烯酸鈉>黃原膠>CMC>瓜爾膠>卡拉膠。其中聚丙烯酸鈉的吸水率太大，并且吸濕性極強，暴露在空氣中時很容易結塊黏連，不適合單獨用于測試卡的制作[19]。對各凝膠培養8 h后，凝膠保水率差別較小；24 h后，保水率發生顯著變化，各凝膠之間的差別也較明顯，各凝膠保水率大小順序為：聚丙烯酸鈉>瓜爾膠>CMC>黃原膠>卡拉膠。

表1 凝膠劑的吸水率與保水率?Table 1 Water absorption and water retention of gels (n=3) %

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

由表2可知，卡拉膠、聚丙烯酸鈉、瓜爾膠均可以快速吸水，使水在膠粉內快速擴散；其中以卡拉膠擴散速度最快，瓜爾膠次之，聚丙烯酸鈉最慢。但在黃原膠與CMC中水擴散極為緩慢。CMC、聚丙烯酸鈉、黃原膠可完全凝固成膠，但黃原膠凝固后氣泡較多；卡拉膠、瓜爾膠未能完全凝固，成流動狀態。此外各凝膠劑中黃原膠成本最高、卡拉膠和瓜爾膠次之、CMC與聚丙烯酸鈉最低。

表2 凝膠劑的水擴散速度和成膠情況Table 2 Gel water diffusion speed and gel conditions

凝膠劑基本性能試驗的結果表明，選用以上任何單一凝膠劑均不能滿足菌落總數測試卡用冷水溶性凝膠的要求。綜合考慮各凝膠劑的吸水率、保水率、水擴散速度、成膠狀況和成本，需將凝膠進行組合優化。

2.2 凝膠組合優化

從表3可知，由于水不易在黃原膠膠粉內擴散，故需在黃原膠中加入卡拉膠以增加其水擴散性，但加入卡拉膠后不能形成可凝固的凝膠；將聚丙烯酸鈉分別與CMC、瓜爾膠進行混合，但混合后擴散速率較慢且極易吸潮聚團，不能成膠；只有卡拉膠與CMC、瓜爾膠混合時具有較好的水擴散速度和成膠性。

比較卡拉膠與CMC、瓜爾膠組合的凝膠物性發現(表4)，卡拉膠與CMC組合的凝膠物性顯著好于卡拉膠與瓜爾膠組合，且卡拉膠與CMC組合的成本更為經濟，綜合考慮選取卡拉膠與CMC按2∶1的質量比混合為宜。

表3 不同凝膠組合的水擴散速度和成膠情況Table 3 Gel combination water diffusion speed and gel combination conditions

表4 不同凝膠組合的物性比較?Table 4 Gel composition properties comparison (n=3)

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 培養基與凝膠的比例優化

培養基與凝膠的混合比例將直接影響到菌落檢測的效果。適合的比例才能使其在加水后迅速溶解形成凝膠培養基，滿足微生物正常生長代謝的需求，并起到承載微生物的作用?；旌夏z粉與培養基分別按1∶2，1∶1，2∶1的質量比混勻制成培養基凝膠。由表5可知，在37 ℃下不同時間點的pH基本保持穩定并成中性，表明培養溫度、混合比例和培養時間的改變對pH影響不大。

而在37 ℃恒溫培養24 h后，按照上述混合比例制作的培養基凝膠的物性、透光度、成膠效果和菌落生長狀況均有較大的差異(表6)，其中隨著混合膠粉比例的增加，培養基凝膠物性指標和透光度都相應地提高，以質量比2∶1制備的培養基凝膠在物性指標和透光度上顯著優于其他2組。此外雖然制作的培養基凝膠均能在5 min內凝固成膠，但在37 ℃ 下培養24 h后，以1∶1，1∶2質量比制備的培養基凝膠出現了部分融化，嚴重影響菌落生長。而以2∶1質量比制備的培養基凝膠仍然保持凝固狀態，整體透明度好且菌落生長正常、分布均勻易于計數。因此，以混合凝膠粉與培養基按質量比2∶1混合為最優。

表5 37 ℃恒溫培養期間凝膠的pHTable 5 pH of gel during cultivation (n=3)

表6 不同比例凝膠的物理特性及菌落生長情況?Table 6 Physical properties of different proportions of gels and colony growth (n=3)

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.4 TTC的含量優化

TTC對菌落的顯色相對于其他顯色劑更為靈敏準確，而且在常溫下它與菌落形成的顏色在空氣中十分穩定，可以保存較長時間，方便計數。但其濃度對微生物生長卻有顯著影響，需要對其使用濃度進行優化[20]。

如表7所示，當TTC濃度在0.025 mg/mL以下時，菌落生長分布均勻且與對照組無顯著差異；但TTC濃度超過0.030 mg/mL 時，菌落數量顯著低于對照組，表明微生物的生長受到抑制。而當TTC濃度為0.025 mg/mL時對菌落的染色比0.020 mg/mL更加清晰可辯，暴露在空氣中也更加穩定。因此，以TTC在培養基中實際濃度0.025 mg/mL為最優加入量。

表7 TTC濃度對菌落總數的影響?Table 7 Total number of colonies at different concentrations of TTC (n=3)

? 同行不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.5 與平板法的檢測比較

采用最優條件的測試卡片法與傾注培養法進行對比，發現二者在菌落生長的形態上無明顯差異。由表8可知，2種方法在各稀釋濃度上的菌落計數結果并無顯著差異。

表8 2種不同方法的菌落數Table 8 Number of colonies in two different ways (n=3) CFU/mL

3 結論

采用卡拉膠和CMC在2∶1的質量比下制成混合凝膠劑，再與培養基粉以2∶1的質量比混合制成的凝膠培養基用于制備菌落總數測試卡片具有較好的效果，在TTC濃度為0.025 mg/mL時，菌落顯色效果最佳且不會對細菌生長產生抑制作用。在該條件下采用測試卡片法與傾注培養法對微生物菌落總數的檢測結果無顯著差異。

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