高效液相色譜法測定花生醬中黃曲霉毒素B1結果不確定度的評定

肖利龍XIAO Li-long 花 錦

(1. 太原學院，山西 太原 030032；2. 山西出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，山西 太原 030032)

黃曲霉毒素(aflatoxin，AFT)是一類具有類似化學結構，由黃曲霉 (aspergillus flavus) 寄生曲霉 (A.parasiticus) 產生的強毒性和強致癌性的次生代謝產物組成[1]，主要成分有B1、B2、G1和G2。環境潮濕的地區存放食品和飼料中容易滋生黃曲霉毒素，其中黃曲霉毒素B1，被世界衛生組織劃定為1類致癌物，其毒性是砒霜的68倍，對肝臟組織的破壞性極強，經常會在花生、玉米及其制品中檢出[2]。黃曲霉毒素對人及動物肝臟組織有很嚴重的破壞作用會導致肝癌或死亡。黃曲霉毒素B1經常被報道污染食品，其他3類物質少見報道[3]。因此，許多國家規定了黃曲霉毒素在食品中的限量值。中國GB 2761—2017《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》明確規定花生中黃曲霉毒素B1不得高于20 μg/kg。

目前研究各類食品檢測方法的不確定度評定報道很多[4-6]，黃曲霉毒素B1的不確定度評估也有相關研究[7-8]，但在花生醬中的黃曲霉毒素B1的檢測方法不確定度評估尚未見，在日常檢測過程中，發現花生醬中黃曲霉毒素B1檢出不合格率較高。

為了評估方法的不確定度，保證檢驗結果評定的準確性、可靠性，提供真實、有效的依據。根據GB 5009.22—2016《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》的試驗方法，對本實驗室測定花生醬中黃曲霉毒素B1結果的測量不確定進行評定。評定從兩個方面進行：方法重復性的不確定度和方法數學模型中涉及的各個分量的不確定度。以期為測量結果提供科學、準確的理論依據，同時為其他農產品中黃曲霉毒素B1不確定度的評定提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

花生醬：山西省食品藥品監督管理局監督抽檢樣品；

黃曲霉毒素B1標準溶液：1 mg/L，中國計量科學研究院；

乙腈、甲醇：色譜純，美國Fisher公司；

氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉、鹽酸、吐溫-20：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；

高效液相色譜儀：Waters2695型，配有FLD檢測器，美國Waters公司；

電子分析天平：ME204E型，瑞士Mettler公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液配制 準確移取黃曲霉毒素B1標準溶液1 mL 于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成100 μg/L黃曲霉毒素B1標準儲備溶液。吸取1 mL黃曲霉毒素B1標準儲備溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容制成標準中間溶液。再分別移取1，2，5，8，10 mL黃曲霉毒素B1標準中間溶液于10 mL容量瓶中，用水定容制成標準工作溶液。

1.2.2 樣品制備 準確稱取10 g花生醬樣品于250 mL三角瓶中，加甲醇-水(體積比70∶30)100 mL，均質提取5 min，提取液取15 mL再加入15 mL水稀釋，待凈化。

取1.2.2中獲得的待凈化液10 mL過免疫親和柱，再用20 mL水進行淋洗，最后用1 mL甲醇洗脫，洗脫液經0.45 μm 有機系濾膜過濾上機。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：Agela C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；柱溫：35 ℃；流動相：甲醇∶水=50∶50(體積比)；流速：1 mL/min；激發波長：365 nm；檢測波長：436 nm；進樣體積：20 μL。

1.3 被測量的數學模型

(1)

式中：

X——試樣中AFB1的含量，μg/kg；

ρ——進樣溶液中AFB1按照外標法在標準曲線中對應的濃度，ng/mL；

V1——試樣提取液體積(植物油脂、固體、半固體按加入的提取液體積；醬油、醋按定容總體積)，mL；

V3——樣品經免疫親和柱凈化洗脫后的最終定容體積，mL；

V2——用于免疫親和柱的分取樣品體積，mL；

1 000——換算系數；

m——試樣的稱樣量，g。

2 分析和量化不確定度分量

高效液相色譜法測定花生醬中AFB1需經過提取、凈化、等步驟，每個步驟都可能引入不確定度(圖1)。要對每個步驟都確定其不確定度的量是相對困難的，最常見的方法是選擇檢測方法評價中的數據進行評價，對各分量進行統一評定。

圖1 花生醬中AFB1測定不確定度來源因果圖Figure 1 Uncertainty source of determination for AFB1 in peanut butter

不確定有多種不同來源，其中有部分隨機性誤差可以通過重復測量排除，用統計方式評定，是為A類評定；但是也有許多其他不確定度的來源，例如儀器本身的不確定度，不能用重復測量和統計方式評定，要用B類評定方法，本方法中除標準物質純度引入的不確定度為B類評定，其余分量的不確定度均采用A類評定。

2.1 質量的不確定度

由檢定證書查得，該電子天平在0≤m≤100 g范圍示值誤差為±0.000 1 g，實際稱取樣品10.068 5 g，按照均勻分布，稱量引入的相對標準不確定度為：

2.2 體積的不確定度

本方法體積的不確定度主要來源于校準和溫度。

2.2.1 校準 本方法實際定容體積為1.0 mL，定容體積的準確與否直接影響著最終的結果。用移液槍獲得該體積，按照JJG 646—2006《移液器檢定規程》，A級1 mL的移液槍最大允許差為0.01 mL，按三角分布處理，由此引入的標準不確定度為：

2.2.2 溫度 實驗室的溫度在(20±2) ℃變化，水的膨脹系數是2.1×10-4，按照均勻分布，溫度差異引入的相對標準不確定度為：

2.2.3 體積不確定度的合成

(2)

計算得到：urel(V)=0.000 59%。

2.3 標準工作溶液引入的不確定度

2.3.1 標準物質純度引入的不確定度 本檢測方法所購買的標準物質來自德國Dr.Ehrenstorfer公司，純度為(99.0±1.0)%，從標準物質證書上查得其標準不確定度為：urel(P)=0.025%。

2.3.2 標準工作液配制過程引入的不確定度 使用經過計量校準的分量為0.1 mg的天平上稱取標準品，使用A級100 mL 的容量瓶進行配制，在稀釋過程中，100 mL的容量瓶、1 mL量程的移液槍分別使用2次。

根據JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規程》，查得所使用的A級100 mL容量瓶和1 mL量程移液槍的最大允許差分別為±0.10 mL和±0.008 mL，因此由容量瓶和移液槍引入的不確定度分別為：

稀釋操作時，在相同的溫度下使用移液槍和容量瓶，因此可忽略溫度對不確定度的影響。

2.3.3 標準曲線擬合引入的不確定度 配制質量濃度為1，2，5，8，10 ng/mL的5個校準標準溶液，通過高效液相色譜儀計算得出該標準曲線方程為y=0.103 8x+0.012 5，計算得到標準曲線的不確定度僅與儀器的響應值高度有關。黃曲霉毒素校準溶液測定結果見表1。

黃曲霉毒素B1校準曲線引入的不確定度：

表1 黃曲霉毒素校準溶液測定結果?Table 1 Result of determination for AFB1 calibration solution

?p=5，N=6，c均=5 ng/mL，c0=0，b=0.103 8。

2.3.4 標準工作液濃度不確定度的合成

urel(cs)=

(3)

經計算標準工作液濃度合成不確定度urel(cs)=0.033%。

2.4 進樣體積引入的不確定度

數學模型中雖然并沒有涉及進樣量，但在計算結果中使用了進樣量。進樣量的變動可以包含在重復性考慮中。在實際的檢測過程中采用同一進樣器采樣定量環等體積進樣，進入儀器的標準工作溶液和樣品時溫度是固定的，因此溫度帶入的不確定度影響可以忽略，進樣體積引入的不確定度也可以忽略。

2.5 樣品前處理過程引入的不確定度

對本方法進行正確度試驗，選擇1個空白樣品進行6次加標回收試驗，回收率測定結果分別為88.1%，89.2%，87.8%，94.3%，92.7%，89.9%，得到平均回收率frec為90.3%，則由樣品前處理過程引入的相對標準不確定度為：

(4)

(5)

計算得出Sfrec=0.038 6，urel(frec)=1.05%。

2.6 測量重復性的不確定度

在上述試驗條件下，對某陽性樣品進行了6次重復測定，測得黃曲霉毒素含量分別是24.35，25.46，25.63，25.78，24.37，25.12 μg/kg，平均值為25.12 μg/kg，則由樣品重復性引入的相對標準不確度為：

(6)

(7)

2.7 合成不確定度

方法重復性引入的不確定度、數學模型中各分量引入的合成不確定度：

Urel(X)=

(8)

通過計算得出：Urel(X)=1.051%。

2.8 擴展不確定度

按照包含因子k=2(置信水平 95%)，計算得出花生醬中黃曲霉毒素B1液相色譜檢測法的相對擴展不確定度：Urel=k×Urel(X)=2×1.051%=2.102%。

擴展不確定度：U=25.12×2.102%=0.528 μg/kg。

3 測量結果及其不確定度的報告

用高效液相色譜法測定花生醬中黃曲霉毒素B1含量，測定結果可表示為：X=(25.12±0.528) μg/kg，k=2。

4 結論

方法的重復性或再現性只能評價n次試驗結果，不確定

度包含著與測試相關的各個因素(方法、設備、環境等等)的廣泛信息，說明檢測質量和檢測過程，再現性屬于不確定度評估的一部分。本文對花生醬中黃曲霉B1的檢測過程進行了不確定度分析，發現影響檢測結果的不確定因素(天平稱量、前處理的過程、標準溶液的配制過程及濃度、樣品溶液定容體積、重復性)。對于這些不確定度的影響，可以通過調整儀器的性能、增加標準溶液的濃度點、優化前處理凈化過程等方法，降低以上不確定度分量在實際檢測樣品中的不確定度占比，提高測量結果的可信度。

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