有機酸對泡菜中亞硝酸鹽的降解作用

商景天SHANG ng-tian 王修俊 - 王繼輝 -

(1. 貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州大學發酵工程與生物制藥省級重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

泡菜又稱腌漬菜、發酵蔬菜，是以新鮮蔬菜作為原料，加入一定濃度的食鹽與各種香辛調味料后置于密封厭氧環境下泡制，通過蔬菜本身附著的細菌或人工接種的乳酸菌劑發酵而成的一種傳統發酵食品[1]。泡菜加工工藝簡單、成本低廉，口感獨特、營養豐富，深受大眾的喜愛。

亞硝酸鹽的積累是泡菜發酵過程中常見問題[2]。亞硝酸鹽在人體內會積累轉變為強致癌物質——亞硝胺，進而誘發急性中毒，食用亞硝酸鹽對人體健康構成危害的途徑有以下3種類型：① 亞硝酸鹽能氧化血液中的低鐵血紅蛋白生成高鐵血紅蛋白，導致低氧血癥，引起組織缺氧，產生一系列相應的中毒癥狀[3-4]；② 廣泛的試驗和流行病學數據表明，亞硝酸鹽內源性亞硝化反應所產生的N-亞硝基化合物容易致癌[5-7]；③ 亞硝酸鹽會引起人體心血管系統的紊亂，導致心跳加快，血脂降低，并引起維生素A缺乏癥[8]。因為亞硝酸鹽中毒后發病迅速、潛伏期短，危害性極大[9]，所以如何控制發酵過程并運用化學、生物方法降低泡菜中亞硝酸鹽的含量已成為了國內外學者的研究重點。

Klampfl等[10-11]發現蔬菜中含有草酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、酒石酸、乙酸、富馬酸等多種有機酸。胡繼貴等[12]用高效液相色譜法測得泡菜樣品中含有乙酸、檸檬酸、蘋果酸和草酸。鄒輝等[13]研究表明草酸、檸檬酸、乳酸等對食品中亞硝酸鹽有顯著的降解作用。劉曉英[14]研究了泡菜發酵中產生的草酸等有機酸對亞硝酸鹽含量的影響，結果表明在12 h反應周期內不同有機酸對亞硝酸鹽的降解能力有較大差別，且酸度越大降解率越高。因此泡菜中所含的有機酸是亞硝酸鹽降解的主要原因之一。但泡菜發酵周期較長，而目前文獻對于不同有機酸在較長周期內對亞硝酸鹽的降解規律鮮有報道。

本試驗以蘿卜為原料，研究蔬菜在發酵過程中產生的有機酸種類，并模擬泡菜中有機酸種類進行72 h體外試驗，進一步探究不同種類和不同濃度的有機酸對亞硝酸鹽的降解作用，為有機酸降解泡菜發酵過程中產生的亞硝酸鹽的機理研究提供參考依據，同時為提高工業加工泡菜的安全性提供基礎研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

蘿卜：貴陽市花溪區吉林村農貿市場；

白砂糖：食用級，武漢成達食品有限公司；

食鹽：食用級，四川久大制鹽有限公司；

甲醇、異丙醇：色譜級，天津市科密歐化學試劑有限公司；

磷酸：分析純，天津市富宇精細化工有限公司；

磷酸二氫鉀：分析純，天津市大茂化學試劑廠；

草酸、乳酸、乙酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、丁二酸：色譜級，美國Sigma公司；

亞硝酸鈉：分析純，成都金山化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

電子精密天平：FA2002B型，上海越平科學儀器有限公司；

電熱鼓風恒溫干燥箱：GZX-GF101-3-BS-II型，上海賀德實驗設備有限公司；

分光光度計：722型，上海佑科儀表儀器有限公司；

高效液相色譜儀：Agilent1260型，安捷倫科技有限公司；

色譜柱(250 mm×4.6 mm×5.0 μm)：ZORBAXSB-Aq型，安捷倫科技有限公司；

貝克曼離心機：Allegrax-30RCentrifuge型，貝克曼庫爾特有限公司。

1.2 方法

1.2.1 發酵蘿卜工藝路線

工藝要點：

(1) 成品1用于有機酸高效液相色譜分析，成品2用于分析不同有機酸種類對泡菜中亞硝酸鹽含量的影響。

(2) 泡菜需切分成長寬高為2 cm×2 cm×2 cm的小正方體。

(3) 鹵水配置：4%食鹽和0.7%蔗糖以及其他輔料，以蘿卜∶鹵水=1∶1.5的質量比配置。

(4) 水封需用8%食鹽水，發酵溫度為30 ℃。

(5) 加酸步驟需用草酸、乳酸、乙酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、丁二酸分別調節發酵液初始pH值為3.0，4.0。

1.2.2 亞硝酸鹽標準曲線的繪制 從5 μg/mL的亞硝酸鈉標準液中吸取0.00，0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mL于25 mL具塞比色管中，加入2 mL對氨基苯磺酸溶液(4 g/L)，混勻后靜置3～5 min，再加入1 mL鹽酸萘乙二胺(2 g/L)，加水至刻度，混勻，靜置15 min，用2 cm 玻璃比色皿，以蒸餾水為空白對照，于波長538 nm處以零管調節零點來測定吸光度值，繪制標準曲線[15]。

1.2.3 泡菜中亞硝酸鹽含量的測定 采用分光光度法[16]，亞硝酸鹽含量按式(1)計算：

(1)

式中：

X1——試樣中亞硝酸鹽(以亞硝酸鈉計)的含量，mg/kg；

A1——由標準曲線計算得到被測試樣中亞硝酸鈉的含量，μg；

m——試樣質量，g；

V1——測定用樣液體積，mL；

V0——試樣處理液總體積，mL。

1.2.4 發酵蔬菜中總酸含量的測定 根據GB/T 12456—2008，采用pH電位法測定總酸含量，總酸度按式(2)計算：

(2)

式中：

X2——總酸度(以乳酸計)，g/100 g；

V——滴定時消耗標準NaOH溶液的量，mL；

C——已知NaOH標準溶液的濃度，mol/L；

M——樣品質量，g；

K——換算系數，乳酸的換算系數為0.09。

1.2.5 泡菜中有機酸種類的測定

(1) 有機酸標準溶液的配制：準確稱取色譜級草酸、乳酸、乙酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、丁二酸用超純水配制成0.1 mg/mL 的有機酸混合儲備液，將儲備液于2 ℃冰箱中保存，使用前混標溶液經0.45 μm水系濾膜過濾后上樣分析[17]。

(2) 樣品前處理：準確稱取經過研缽研磨后混勻的樣品2.500 0 g于50 mL小燒杯中加入適量超純水，75 ℃水浴20 min，在水浴的過程中攪拌1～2次使有機酸充分溶出，冷卻后用超純水定容到50 mL。過濾取濾液離心(10 000 r/min，10 min)，上清液經0.45 μm水系濾膜過濾后上機分析[18]。

(3) 色譜檢測：由于SB-Aq柱適合用于難以分離的堿性、酸性以及極性化合物的分離測定，而且保留分離作用比傳統的C18色譜柱性能更強[19-21]。因此，選擇SB-Aq色譜柱進行分離。

磷酸鹽緩沖溶液體系比較適合用于有機酸成分的分析。試驗研究了各種待測有機酸的最大吸收峰值，最終確定了相對較優的分離條件：色譜柱為SB-Aq(250 mm×4.6 mm×5.0 μm)，流動相為97%pH值為2.0的0.02 mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液(經0.45 μm水系濾膜抽濾，超聲脫氣30 min)和3%的色譜級甲醇溶液(經0.45 μm有機相濾膜過濾，超聲脫氣30 min)，紫外檢測波長為210 nm，流速為0.8 mL/min，進樣量為10 μL，柱溫30 ℃，DAD檢測器[22]。通過有機酸標準品色譜峰的保留時間與樣品中有機酸成分的保留時間進行對照，對泡菜中有機酸種類進行分析。

1.2.6 溫度對有機酸降解亞硝酸鹽的影響 分別吸取1 mL濃度為0.07 g/mL草酸、乳酸、乙酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、丁二酸溶液與濃度為160 μg/mL的亞硝酸鹽溶液反應，反應液為40 mL，反應溫度分別設置為10，20，30，40，50 ℃，12 h后用移液槍吸取1 mL反應液于25 mL帶塞比色管中測定吸光度值，計算亞硝酸鹽降解率。

1.2.7 有機酸種類濃度對亞硝酸鹽降解的影響 分別吸取濃度為0.03，0.07，0.11，0.15，0.19 g/mL草酸、乳酸、乙酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、丁二酸溶液各1 mL于40 mL濃度為160 μg/mL的亞硝酸鹽溶液中，混勻后于30 ℃下反應，每隔12 h取1 mL于25 mL帶塞比色管中測定吸光值用于計算亞硝酸鹽降解率。亞硝酸鹽降解率按式(3)計算：

(3)

式中：

X3——亞硝酸鹽降解率，%；

m0——未加入有機酸時亞硝酸鹽的含量，μg；

m——加入有機酸后亞硝酸鹽的含量(以標準曲線計算)，μg。

1.3 試驗數據統計分析

數據采用平均值±標準差表示，采用SPSS 1.90對組間和組內數據進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 亞硝酸鹽標準曲線的繪制

亞硝酸鹽含量標準曲線見圖1。

圖1 亞硝酸鹽含量測定標準曲線Figure 1 The standard curve of sodium nitrite content

2.2 泡菜發酵過程中總酸含量和有機酸種類的測定

2.2.1 總酸含量變化 由圖2可以看出，蘿卜在發酵過程中，0～120 h階段總酸含量隨著發酵時間的延長呈現上升的趨勢，120 h之后隨著發酵的繼續，總酸含量基本趨于穩定，發酵168 h時總酸含量達到最高為0.195 g/100 g。其原因主要是在發酵初期，乳酸菌大量生長繁殖，成為優勢菌群，發酵速度快，總酸含量增加迅速，而后進入發酵中后期，乳酸菌產生有機酸導致腌漬液總酸含量增加，抑制乳酸菌的生長代謝，總酸含量趨于穩定。

圖2 自然發酵過程中總酸含量變化Figure 2 Changes of total acid content in natural fermentation process

2.2.2 有機酸種類 試驗在較優的色譜分離條件下，通過測定單一有機酸標準品和混合有機酸標準品對每種有機酸的保留時間進行測定，從而對每種有機酸進行定性分析，有機酸標準品色譜圖以及泡菜中有機酸色譜圖分別見圖3、4。

從圖3、4中可以看出，各種有機酸在較短的時間內得到了分離，泡菜在腌制過程中，產生的有機酸種類主要有草酸、酒石酸、乳酸、乙酸、琥珀酸等有機酸。

2.3 溫度對有機酸降解亞硝酸鹽的影響

從圖5可以看出，亞硝酸鹽降解率隨著反應溫度的升高而增大，10 ℃時除乙酸和丁二酸亞硝酸鹽降解率未能達到60%以上，另外5種有機酸亞硝酸鹽降解率都在60%以上，其中乙酸亞硝酸鹽降解率為46.79%、丁二酸亞硝酸鹽降解率為51.62%，而亞硝酸鹽降解率最高為草酸70.86%，與亞硝酸鹽降解率最低的乙酸相比，相差24.07%。10～30 ℃時亞硝酸鹽降解速率增加較快，30～50 ℃時亞硝酸鹽降解速率有所減緩，但仍在增加。其中7種有機酸對亞硝酸鹽降解能力的順序為草酸>酒石酸>檸檬酸>蘋果酸>乳酸>丁二酸>乙酸。

1. 草酸 2. 酒石酸 3. 蘋果酸 4. 乳酸 5. 乙酸 6. 檸檬酸 7. 琥珀酸

圖3 有機酸混合標準樣品色譜圖

Figure 3 Chromatogram of mixtures of organic acid standard sample

1. 草酸 2. 酒石酸 3. 乳酸 4. 乙酸 5. 琥珀酸圖4 發酵樣品有機酸色譜圖Figure 4 Organic acid chromatogram of fermentated sample

圖5 溫度對有機酸降解亞硝酸鹽的影響Figure 5 Effect of temperature on degradation of nitrite by organic acid

2.4 有機酸對亞硝酸鹽降解作用的影響

通過高效液相色譜對泡菜發酵過程中產生的有機酸種類進行測定，得到了泡菜中有機酸的成分，進而對不同有機酸種類濃度降解亞硝酸鹽進行研究，鑒于蘋果酸和檸檬酸是泡菜中常見的2種有機酸，也是食品添加劑中常用的，因此也一并進行研究。

不同濃度有機酸對亞硝酸鹽降解的影響見表1。

從表1可以看出，7種有機酸濃度的增加都會使亞硝酸鹽降解率表現為增大的趨勢，反應初期亞硝酸鹽降解速率較快，隨著降解反應的進行，亞硝酸鹽降解速率逐漸減慢，但亞硝酸鹽降解率仍繼續增加。而隨著降解反應的進行，各組空白亞硝酸鹽溶液中亞硝酸鹽不發生降解，說明在自然條件下亞硝酸鹽是很難發生降解的。

表1 酸濃度對降解亞硝酸鹽的影響?Table 1 Effects of different concentrations of acid on nitrite degradation %

續表1

種類濃度/(g·mL-1)反應時間/h01224364860720.000.00±0.00a0.00±0.00d0.00±0.00c0.00±0.00c0.00±0.00c0.00±0.00c0.00±0.00c 蘋0.030.00±0.00a74.57±0.98c85.01±3.82b90.33±2.42b92.80±1.50b95.07±1.55b96.33±0.85b 果0.070.00±0.00a82.25±1.18b90.02±2.79a93.83±2.81a95.91±1.95a97.09±1.54ab97.81±1.25ab 酸0.110.00±0.00a84.49±2.12a91.54±1.64a95.07±2.04a96.57±1.43a97.72±0.94a98.28±0.95a 0.150.00±0.00a85.08±0.47a92.22±1.37a95.50±1.24a96.78±1.40a97.81±1.25a98.37±1.55a 0.190.00±0.00a85.59±1.04a92.49±1.22a95.61±1.65a97.13±0.87a98.06±1.41a98.59±0.11a 0.000.00±0.00a0.00±0.00d0.00±0.00c0.00±0.00c0.00±0.00c0.00±0.00c0.00±0.00c 檸0.030.00±0.00a74.07±1.06c84.20±1.07b90.11±2.46b92.76±0.71b94.01±1.26b96.01±1.54b 檬0.070.00±0.00a82.07±1.19b90.17±0.82a94.28±2.56a95.92±2.31a97.29±1.16a97.94±0.66a 酸0.110.00±0.00a83.17±1.75b91.77±0.77a95.14±0.72a96.66±1.60a97.83±1.30a98.44±1.11a 0.150.00±0.00a85.73±2.45a92.33±2.57a95.59±1.73a97.02±0.55a98.03±1.12a98.59±0.85a 0.190.00±0.00a85.86±0.89a92.62±3.25a95.97±2.04a97.25±2.50a98.19±1.15a98.71±0.93a 0.000.00±0.00a0.00±0.00f0.00±0.00e0.00±0.00d0.00±0.00d0.00±0.00d0.00±0.00d 丁0.030.00±0.00a57.41±0.96e66.44±0.79d75.67±1.01c81.33±1.40c85.30±2.31c88.40±2.52c 二0.070.00±0.00a69.52±0.86d81.19±1.16c87.23±0.99b90.87±0.97b93.09±0.32b94.44±1.20b 酸0.110.00±0.00a74.66±0.81c85.17±1.03b90.85±1.45a93.21±1.37a95.20±0.91a96.42±0.82ab 0.150.00±0.00a77.62±1.24b86.69±1.40ab91.68±1.25a94.08±1.02a95.38±0.85a96.66±1.04ab 0.190.00±0.00a79.37±1.11a87.97±1.70a92.67±1.15a95.02±2.08a96.42±0.77a97.31±0.55a

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

反應12 h時，草酸除空白外，5個濃度之間亞硝酸鹽降解率均在80%以上；草酸濃度為0.19，0.15 g/mL之間亞硝酸鹽降解率沒有顯著性差異，但是與0.03，0.07，0.11 g/mL之間存在差異。乳酸濃度為0.03，0.07 g/mL時亞硝酸鹽降解率分別為70.53%，79.15%，除空白外，其他乳酸濃度亞硝酸鹽降解率都達到了80%；濃度0.19，0.15，0.11 g/mL之間除12 h外其他均不存在差異(P>0.05)，0.03 g/mL與其他4個濃度之間均存在差異(P<0.05)。乙酸濃度0.03 g/mL時亞硝酸鹽降解率僅為46.72%，與乙酸濃度為0.19 g/mL亞硝酸鹽降解率相差29%；濃度0.03，0.07，0.11 g/mL與0.19，0.15 g/mL之間均存在差異(P<0.05)，且0.03，0.07，0.11 g/mL 兩兩之間也存在差異(P<0.05)。酒石酸濃度為0.03，0.19 g/mL時亞硝酸鹽降解率分別為75.85%，87.17%，相差11%；濃度0.19，0.15，0.11 g/mL之間在36 h時和60 h后不存在差異(P>0.05)，0.03 g/mL與其他濃度之間均存在差異(P<0.05)。蘋果酸濃度除0.03 g/mL亞硝酸鹽降解率為74.57%，其他濃度亞硝酸鹽降解率均能達到80%以上；濃度0.19，0.15，0.11 g/mL之間不存在差異(P>0.05)，其他濃度兩兩之間存在差異(P<0.05)。檸檬酸濃度為0.03 g/mL時亞硝酸鹽降解率為74.07%，與最高濃度亞硝酸鹽降解率85.86% 相差12%；濃度0.19，0.15 g/mL與0.11，0.07 g/mL之間除12 h以外均不存在差異(P>0.05)。丁二酸各濃度亞硝酸鹽降解率分別為57.41%，69.52%，74.66%，77.62%，79.37%，最低濃度與最高濃度亞硝酸鹽降解率相差22%，兩兩之間均存在差異(P<0.05)。

反應72 h時，草酸各濃度組亞硝酸鹽基本完全降解。乳酸濃度0.03，0.19 g/mL亞硝酸鹽降解率的差異不明顯。乙酸除濃度為0.03 g/mL亞硝酸鹽降解率為81.93%，其他濃度亞硝酸鹽降解率均在90%以上。酒石酸濃度0.03 g/mL 亞硝酸鹽降解率為97.40%，與0.19 g/mL亞硝酸鹽降解率98.91%僅相差1.5%。蘋果酸濃度0.03 g/mL與0.19 g/mL 亞硝酸鹽降解率僅相差2.3%。檸檬酸濃度0.03 g/mL 與0.19 g/mL亞硝酸鹽降解率相差3.0%。

綜上可知，空白亞硝酸鹽溶液在自然條件下是很難發生降解的，而添加有機酸能有效地對亞硝酸鹽實施降解，以上有機酸濃度為0.07 g/mL，反應12 h時，亞硝酸鹽降解率均能達到60%以上，反應72 h時，7種有機酸基本能完全降解亞硝酸鹽。

3 結論

本試驗結果表明泡菜中含有的草酸、酒石酸、乳酸、乙酸、琥珀酸等有機酸均能降解亞硝酸鹽，降解率也隨有機酸起始濃度的增加而增大，其中草酸對亞硝酸鹽降解能力最強，可能與其有很強的還原性有關。亞硝酸鹽的降解率隨著反應溫度的升高而增大，但是由于泡菜發酵菌種的最適生長溫度為30 ℃左右，因此后續試驗反應溫度選擇為30 ℃。本試驗進一步探究了在72 h反應周期下有機酸對亞硝酸鹽的降解規律，但對于不同有機酸降解亞硝酸鹽的產物問題仍需進一步研究。

[1] 閆凱. 泡菜發酵工藝及保藏性的研究[D]. 武漢: 華中農業大學, 2013: i.

[2] HASHIMOTO T. The Cause on the abnormal accmulation of nitrite in pickles of chinese cabbage (Brassica pekinesis Rupr)[J]. Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi, 2001, 48(6): 409-415.

[3] COCKBURM A, BRAMBILLA G, FERNANDEZ M L, et al. Nitrite in feed: From Animal health to human health[J]. Toxicology & Applied Pharmacology, 2013, 270(3): 209-217.

[4] 張英. 亞硝酸鹽在肉制品中的作用及其替代物的研究現狀[J]. 江蘇調味副食品, 2012(6): 22-24.

[5] 毛青秀, 鄧鋼橋, 鄒朝輝, 等. 蔬菜中亞硝酸鹽降解方法研究進展[J]. 湖南農業科學, 2012(7): 109-111.

[6] CABALLERO-SALAZAR S, RIVERON-NEGRETE L, ORD-AZ-TELLEZ M G, et al. Evaluation of the antimutagenic activity of different vegetable extracts using an in vitro screening test[J]. Proc West Pharmacol Soc, 2002, 45: 101-103.

[7] KIM S H, KANG K H, KIM S H, et al. Lactic acid bacteria directly degradeN-nitrosodimethylamine and increase the nitrite-scavenging ability in kimchi[J]. Food Control, 2017, 71: 101-109.

[8] 李文婷, 車振明. 泡菜中亞硝酸鹽安全性研究新進展[J]. 中國調味品, 2011, 36(7): 1-3.

[9] 何金奎, 王丹丹. 亞硝酸鹽中毒臨床分析[J]. 中國社區醫師: 醫學專業, 2013, 15(1): 176.

[10] KLAMPFL C W, BUCHBERGER W, HADDAD P R. Determination of organic acids in food samples by capillary zone electrophoresis[J]. Journal of Chromatography A, 2000, 881(1/2): 357-364.

[11] 徐慧敏, 施婷婷, 檀華蓉, 等. 高效液相色譜法同時測定蔬菜中有機酸與磺胺類抗生素[J]. 分析試驗室, 2016(10): 1 135-1 139.

[12] 胡繼貴, 趙雪梅. HPLC法測定泡菜中有機酸的方法探究[J]. 食品與發酵科技, 2017, 53(3): 78-84.

[13] 鄒輝, 劉曉英, 陳義倫, 等. 泡菜(白菜)腌制過程中有機酸對亞硝酸鹽含量的影響[J]. 食品與發酵工業, 2013, 39(11): 29-32.

[14] 劉曉英. 泡菜中有機酸對亞硝酸鹽降解作用及機理的初步研究[D]. 泰安: 山東農業大學, 2013: 20.

[15] 黃珊, 王修俊, 范志平, 等. 復合菌劑對辣椒發酵過程中亞硝酸鹽含量的影響[J]. 中國釀造, 2017, 36(7): 129-134.

[16] 中華人民共和國國家質量監督檢驗疫總局, 中國國家標準化管理委員會. GB 5009.33—2016 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定[S]. 北京: 中國標準出版社, 2016: 4-9.

[17] 賈洪鋒, 賀稚非, 李洪軍, 等. 高效液相色譜法測定發酵辣椒中的有機酸[J]. 食品科學, 2008, 29(3): 374-379.

[18] 王冉, 李小林, 李敏, 等. 反相高效液相色譜法測定泡蘿卜中的有機酸[J]. 食品工業科技, 2014, 35(13): 283-287.

[19] WANG Min, FENG Qiu, SHAN Xiao-quan, et al. Develop-ment and optimization of a method for the analysis of low-molecular-mass organic acids in plants by capillary electrophoresis with indirect UV detection[J]. Journal of Chromatography A, 2003, 989(2): 285-292.

[20] FLORES P, HELLIN P, FENOLL J. Determination of organic acids in fruits and vegetables by liquid chromatography with tandem-mass spectrometry[J]. Food Chemistry, 2012, 132(2): 1 049-1 054.

[21] JIMIDAR M, HARTMANN C, COUSEMENT N, et al. Determination of nitrate and nitrite in vegetables by capillary electrophoresis with indirect detection[J]. Journal of Chromatography A, 1995, 706(1/2): 479-492.

[22] 李志華. 泡菜中五種有機酸的高效液相色譜分離分析[D]. 長沙: 湖南師范大學, 2011: 14.