富硒獅頭柑功能成分和硒有機化程度分析

楊 旭YANG Xu

(1. 安康學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院，陜西 安康 725000；2. 陜西省富硒食品工程實驗室，陜西 安康 725000)

獅頭柑屬蕓香科柑橘屬中的柑類，因其果皮有許多瘤狀突起及明顯肋起與溝紋，形如“獅頭”而得名[1]。獅頭柑果大、耐貯藏、酸甜適度、口感頗佳，含蛋白質(zhì)、碳水化合物、無機鹽、維生素等多種營養(yǎng)成分，具有降火明目、生津止渴等功效[2-3]。依托于中國第二大富硒區(qū)安康獨特的地理地質(zhì)環(huán)境，獅頭柑作為當(dāng)?shù)孛麅?yōu)傳統(tǒng)果品具備天然富硒特色[3-4]。但就目前加工現(xiàn)狀而言，獅頭柑仍以鮮食為主，罐頭、飲料、蜜餞類等深加工產(chǎn)品和從非食用部位提取的功能成分等深加工副產(chǎn)品很少，且資源推廣緩慢[5-6]。已報道的文獻[1-2, 5]多是對獅頭柑果皮、果肉的香氣成分及果實一般營養(yǎng)成分進行探究，而關(guān)于獅頭柑多部位，尤以果汁、柑渣和種子的功能成分和各部位硒元素賦存情況的研究還未見報道，相關(guān)基礎(chǔ)研究的缺乏制約了富硒獅頭柑資源的開發(fā)利用。

本試驗擬探究獅頭柑果實的5個加工部位，即果皮、果肉、果汁、柑渣、種子中總多酚、類黃酮、抗壞血酸、谷胱甘肽和類胡蘿卜素等功能成分的含量，并對各部位中總硒、無機硒含量及硒有機化程度進行分析，以期明確果實各部位的功能成分和硒元素的賦存情況，為富硒獅頭柑的資源推廣、深加工開展和市場開拓提供前期研究，從而尋求富硒獅頭柑及其產(chǎn)品研發(fā)的新方向。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

獅頭柑：安康市旬陽縣市售(產(chǎn)自呂河鎮(zhèn)冬青村)；

硝酸、鹽酸：優(yōu)級純，成都市科龍化工試劑廠；

蘆丁、沒食子酸標品：分析純，上海源葉生物科技有限公司；

類胡蘿卜素、還原型谷胱甘肽標品：分析純，上海如吉生物科技有限公司；

D-無水葡萄糖標品：分析純，上海江萊生物科技有限公司；

硒標準儲備液：1 000 μg/mL，國家標準物質(zhì)研究中心；

其他試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

紫外可見分光光度計：TU-1901型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

低速離心機：LD4-2A型，北京醫(yī)用離心機廠；

恒溫振動水浴鍋：SHA-C型，常州國華電器有限公司；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：GZX-GF101-2-BS型，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；

高速萬能粉碎機：FW-100D型，天津鑫博得儀器有限公司；

壓榨機：JYZ-B6T型，中國九陽股份有限公司；

快速混勻器：XK96-A型，江蘇新康醫(yī)療器械有限公司；

原子熒光光度計：AFS-930型，北京吉天儀器有限公司；

小型控溫加熱板：ECH-Ⅱ型，上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；

溫壓雙控微波消解儀：MDS-6型，上海新儀微波化學(xué)科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料預(yù)處理 獅頭柑樣品清洗后，將果皮、果肉、種子分離，再對部分果肉進行壓榨，粗濾后分別收集果汁和柑渣。果皮、果肉、種子和柑渣置于恒溫干燥箱中，50 ℃干燥24 h后，粉碎過40目篩備用，果汁置于4 ℃保存。

1.2.2 功能成分的測定

(1) 總多酚含量：根據(jù)龔曉等[7]的多酚提取方法略作修改，分別稱取果實不同部分的樣品5 g，按1∶15 (g/mL)的料液比加入70%乙醇溶液，80 ℃水浴回流提取2 h，抽濾后定容至100 mL待測。提取液中總多酚含量測定采用Folin-Ciocalteu比色法[8]，以沒食子酸為標準品，總多酚含量以mg沒食子酸當(dāng)量(gallic acid equivalents，GAE)/g干重表示。

(2) 總黃酮含量：樣品中總黃酮的提取方法同1.2.2(1)所述。提取液中總黃酮含量測定采用氯化鋁-亞硝酸鈉比色法[9]，以蘆丁為標準品，總黃酮含量以mg蘆丁當(dāng)量(rutin equivalents，RE)/g干重表示。

(3) 還原型抗壞血酸含量：根據(jù)黃仁華[10]38-39的抗壞血酸提取方法修改如下，分別稱取果實不同部位的樣品5 g，加入80 mL預(yù)冷的50 g/L三氯乙酸(含5 mmol/L EDTA-Na2)，冰浴研磨成漿，以5%三氯乙酸定容至100 mL，靜置10 min后，15 000×g離心15 min，取上清液待測。提取液中還原型抗壞血酸含量測定采用BP顯色法[11]，以抗壞血酸標品溶液的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。在同樣的反應(yīng)條件下，取1 mL上清液進行測定。

(4) 谷胱甘肽含量：樣品中谷胱甘肽的提取方法同1.2.2(3)所述。提取液中谷胱甘肽的含量測定采用DTNB比色法[12]，以谷胱甘肽標品溶液繪制標準曲線。在同樣的反應(yīng)條件下，取1 mL上清液進行測定。

(5) 類胡蘿卜素含量：參照文獻[13]。

1.2.3 硒元素含量的測定 用體積分數(shù)為10%的HCl溶液稀釋硒標準貯備液至10 μg/L，進樣后原子熒光光度計將硒標準液分別稀釋至0.00，1.00，2.00，4.00，8.00，10.00 μg/L，測定熒光強度值，繪制標準曲線。儀器工作條件參照GB 5009.93—2010和原子熒光光度計應(yīng)用手冊確定，具體參數(shù)見表1。樣品消化方法參照MDS-6型微波消解儀推薦方法[14]略作修改。將獅頭柑鮮果實5個部位分離，搗碎，分別稱取不同部位的樣品1 g于消化管中，加入6 mL硝酸后置于100 ℃控溫加熱板中消化，待不冒黃煙即取出冷卻，而后加入2 mL雙氧水和1 mL硝酸進行微波消解，至消解液無色透明，用體積分數(shù)為10%的HCl溶液定容至10 mL待測。微波消解程序見表2。

表1 原子熒光光度計工作條件Table 1 Operating conditions of atomic fluorescence spectrometer

表2 微波消解程序Table 2 Procedure of microwave digestion

1.2.4 無機硒的提取工藝優(yōu)化

(1) 浸提溫度對浸提液中無機硒含量的影響：準確稱取5份果皮樣品，均為5 g，按照1∶10 (g/mL)的料液比加水，分別置于80，85，90，95，100 ℃水浴浸提10 min，冷卻后抽濾定容至50 mL。加入等體積環(huán)乙烷于磁力攪拌器上常溫攪拌30 min，混合液移至分液漏斗靜置30 min，取水相待測。

(2) 浸提時間對浸提液中無機硒含量的影響：準確稱取5份果皮樣品，均為5 g，按照1∶10 (g/mL)的料液比加水，于90 ℃水浴中分別浸提5，10，15，20，25 min，其他操作同1.2.4(1)所述。

(3) 料液比對浸提液中無機硒含量的影響：準確稱取5份果皮樣品，均為5 g，分別按照1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25 (g/mL)的料液比加水，于90 ℃水浴浸提10 min，其他操作同1.2.4(1)所述。

(4) 響應(yīng)面試驗設(shè)計：根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以浸提溫度、浸提時間和料液比為自變量，浸提液中無機硒含量為響應(yīng)值，進行三因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面試驗。

1.2.5 硒有機化程度分析 準確稱取果皮、果肉、果汁、柑渣、種子樣品各5 g，測定各部分的總硒含量。以優(yōu)化后的無機硒提取工藝條件分別提取各部分的無機硒，并測定硒含量。利用減差法[15]換算出硒有機化程度。

ROSe=[(TSe-ISe)/TSe]×100%，

(1)

式中：

ROSe——硒有機化程度，%；

TSe——總硒含量，μg/100 g；

ISe——無機硒含量，μg/100 g。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)以(均值±標準差)表示，每次樣品的測定均重復(fù)3次。采用SPSS 19.0進行方差分析和差異顯著性分析(P<0.05即為差異顯著)。其中，響應(yīng)面設(shè)計試驗數(shù)據(jù)以均值表示，采用Design Expert 8對數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸擬合分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 富硒獅頭柑各部位功能成分含量

從表3中總多酚含量來看，果皮含量最高，果肉、果渣次之，且兩者含量差異不明顯，果汁為最低。按獅頭柑失重率[16]以干重計的測定數(shù)據(jù)進行總多酚含量換算，均高于龔曉等[7]報道的以鮮重計蘆柑、蜜柑、臍橙、沙田柚果皮、果肉中的總多酚含量；各部分的總黃酮含量變化趨勢與總多酚含量基本一致，但果肉的含量高于柑渣。各部分黃酮類化合物占總多酚含量的56.56%～94.94%，說明獅頭柑中多酚類化合物以類黃酮為主；還原型抗壞血酸、類胡蘿卜素和谷胱甘肽3種成分的含量均為：果皮>果肉>柑渣>種子>果汁，其中前兩種成分與其他柑橘類水果含量相當(dāng)，谷胱甘肽含量則明顯高于甜橙果皮(151.01 nmol/g)和果肉(50.38 nmol/g)中的[10]43。富硒獅頭柑各部位功能成分含量的測定結(jié)果表明了果皮作為非可食部分的再利用價值。

2.2 無機硒提取工藝的優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 硒標準曲線的建立 硒標準曲線見圖1。由圖1可知，標準曲線的回歸方程為I= 214.317 75C+ 9.751 0，R2=0.999 94。結(jié)果表明，硒濃度在0～10 μg/L內(nèi)線性相關(guān)性良好。

表3 富硒獅頭柑各部位中功能成分含量?Table 3 The contents of functional components in various parts of se-enriched Citrus

? 同列不同字母表示相互之間差異顯著(P<0.05)。

圖1 硒標準曲線Figure 1 Standard curve of selenium

2.2.2 單因素試驗結(jié)果

(1) 提取溫度：圖2為浸提液中無機硒含量隨浸提溫度的變化曲線。隨著浸提溫度的不斷升高，浸提液中無機硒含量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，當(dāng)溫度為90 ℃時，無機硒含量達到最大，為(0.155 5±0.003 0) μg/100 g。這是因為開始時提取溫度的升高使溶劑分子有較激烈的運動，在加速滲透進入細胞和軟化細胞壁的雙重作用下，促使獅頭柑果皮中無機硒的傳質(zhì)速度加快而更有利于其溶出。隨著提取溫度的繼續(xù)升高，飽和蒸汽壓增加，即使是使用回流裝置提取，相同試驗條件下提取劑的揮發(fā)作用仍會增強，從而使溶于其中的無機硒部分析出，導(dǎo)致含量的降低。因此，確定無機硒的適宜浸提溫度為85～95 ℃。

不同字母表示相互之間差異顯著(P<0.05)圖2 提取溫度對浸提液中無機硒含量的影響Figure 2 Effect of extraction temperature on inorganic selenium content of extracts

(2) 提取時間：浸提時間對浸提液中無機硒含量影響的試驗結(jié)果見圖3。浸提液中無機硒含量先隨浸提時間的延長而逐漸增大，當(dāng)提取時間為10 min時，無機硒含量達到最大，為(0.145 5±0.004 0) μg/100 g。此階段隨著時間的延長，原料與提取劑之間充分接觸，使無機硒有效溶出。隨后，提取時間繼續(xù)延長，含量反而有所下降，可能是由于時間延長后，其他無效成分溶出對無機硒的溶出產(chǎn)生了影響。因此，確定無機硒的適宜浸提時間為5～15 min。

不同字母表示相互之間差異顯著(P<0.05)圖3 提取時間對浸提液中無機硒含量的影響Figure 3 Effect of extraction time on inorganic selenium content of extracts

(3) 浸提料液比：圖4反應(yīng)了料液比變化對浸提液中無機硒含量的影響。開始時隨浸提劑的增加，無機硒在浸提劑中濃度較低，存在較大的濃度梯度，使其更易溶出，當(dāng)料液比為1∶15(g/mL)時，無機硒含量達到最大，為(0.156 6±0.003 0) μg/100 g。而后此作用效應(yīng)減弱，加之其他無效成分溶出增加，導(dǎo)致無機硒含量隨浸提劑增加反而減小。因此，確定無機硒的適宜浸提料液比為1∶10～1∶20 (g/mL)。

不同字母表示相互之間差異顯著(P<0.05)圖4 料液比對浸提液中無機硒含量的影響Figure 4 Effect of solid-liquid ratio on inorganic selenium content of extracts

2.2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果 在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，進行三因素三水平響應(yīng)面試驗設(shè)計(表4)，包含17組試驗，具體試驗方案及結(jié)果見表5。

采用Design Expert 8軟件對試驗數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸擬合，得到料液比、浸提溫度、浸提時間與無機硒含量之間的回歸方程：

表4 Box-Behnken試驗設(shè)計因素水平表Table 4 Factors and levels of Box-Behnken experiment design

表5 Box-Behnken試驗結(jié)果Table 5 Results of Box-Behnken experiment design

Y=-11.262 19+0.014 991A+0.062 259B+0.243 08C+2.722 74E-004AB+4.286 50E-004AC-4.513 50E-004BC-1.846 10E-003A2-1.700 10E-003B2-1.349 72E-003C2。

(2)

表6為所得回歸模型的方差分析。結(jié)果表明，所得模型F值為6.79，P值為0.009 7，具有顯著性，由此說明建立的回歸方程具有統(tǒng)計學(xué)意義。各因素中，浸提時間、料液比的二次項對綜合指標無機硒的含量影響極顯著，浸提時間的二次項和浸提溫度的二次項對綜合指標無機硒的含量影響顯著。

根據(jù)擬合的多元回歸方程得到各因素對無機硒含量綜合指標影響的響應(yīng)面圖見圖5。通過該組圖可對3個考查因素中任意2個因素及其交互作用進行分析，并確定最佳的因素水平范圍[17]。最終計算分析得到的最優(yōu)組合為料液比1∶15.20 (g/mL)、浸提時間7.42 min、浸提時間91.22 ℃，此時無機硒理論含量為0.169 378 μg/100 g，比表5中第13組試驗結(jié)果稍低，可能是試驗誤差造成的。為了確定所得到的優(yōu)化工藝對無機硒的浸提效果，進行驗證實驗。在最優(yōu)條件下，測得浸提液中無機硒含量為(0.170 8±0.003 6) μg/100 g，與理論最佳值基本一致，說明此方案合理可行。

表6 回歸模型的方差分析結(jié)果Table 6 Results of variance analysis for regression model

圖5 因素交互作用對浸提液中無機硒含量的影響Figure 5 Effect of factor interaction on inorganic selenium content of extracts

2.3 硒有機化程度分析結(jié)果

分別測定富硒獅頭柑5個部位中的總硒含量，在優(yōu)化的無機硒浸提工藝基礎(chǔ)上，提取并測定無機硒含量，分析計算出有機硒含量及硒有機化程度，結(jié)果見表7。

根據(jù)DB61/T 556—2012 富硒食品及相關(guān)產(chǎn)品硒含量標準中富硒鮮水果硒含量為0.02～0.10 mg/kg的規(guī)定，確定選用的獅頭柑達到富硒標準。從表7中可知，富硒獅頭柑不同部位中總硒、無機硒和有機硒含量均為：果肉>種子>果皮>柑渣>果汁，且果肉中3項指標均顯著高于其他部位，說明日常食用部位是獅頭柑中硒的主要富集部位。有機化程度以種子最高，果肉次之，果皮為最低，平均有機化程度可達81.07%，表明以富硒獅頭柑作為膳食補硒源，具有毒性小，硒的吸收率和生物利用率高等特點[18]。

3 結(jié)論

富硒獅頭柑不同部位功能成分的研究結(jié)果表明，總黃酮、還原型抗壞血酸、谷胱甘肽和類胡蘿卜素4項指標均呈現(xiàn)出果皮>果肉>柑渣>種子>果汁的變化趨勢，果皮作為非可食部分，測定的功能成分含量均顯著高于其他部位，因此對果皮的合理利用是將來富硒獅頭柑資源全面開發(fā)的重要方向。與其他柑橘類水果的同種功能成分進行比較，富硒獅頭柑中總多酚和谷胱甘肽含量相對較高，而總黃酮、還原型抗壞血酸和類胡蘿卜素則含量相當(dāng)，說明食用富硒獅頭柑具有較好的功能性營養(yǎng)價值。本研究對富硒獅頭柑中硒的有機化程度進行了分析，通過單因素和響應(yīng)面試驗設(shè)計，確定無機硒的優(yōu)化提取工藝為：料液比1∶15.20 (g/mL)、浸提時間7.42 min、浸提時間91.22 ℃，在此條件下不同部位總硒、無機硒和有機硒含量測定結(jié)果表明，果肉是富硒獅頭柑中硒元素的主要富集部位，且此食用部位的硒有機化程度可達82.85%，證實了其作為膳食補硒源的安全性。后續(xù)可對富棲獅并沒有柑綜合營養(yǎng)品質(zhì)和硒的形態(tài)分析進行研究，以利于其資源的綜合利用和產(chǎn)品質(zhì)量的提升。

表7 富硒獅頭柑不同部位硒有機化程度分析結(jié)果?Table 7 Results oforganic selenium ratio in various parts of se-enriched Citrus

? 同列不同字母表示相互之間差異顯著(P<0.05)。

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