蛋白酶對韌性餅干品質的改良作用

姚曉丹YAO Xiao-dan 徐學明,2 -,2 吳鳳鳳 - 周 星

(1. 江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

韌性餅干的糖油含量約占面粉量的40%，產品形狀多樣，表面平整光滑，口感較松脆、耐咀嚼。由于中國使用的低筋粉筋力較強，易使餅干變形，口感堅硬，高品質的餅干通常難以制作[1]，因此餅干企業會在加工過程中使用焦亞硫酸鈉(SMS)、半胱氨酸(CYS)和蛋白酶等添加劑弱化面筋，改善餅干品質[2]。焦亞硫酸鈉與半胱氨酸具有還原性，在餅干中的應用已有較長歷史，兩者都存在明顯缺陷。焦亞硫酸鈉會破壞餅干中的B族維生素，抑制褐變反應，使得產品顏色發白影響美觀。此外，焦亞硫酸鈉還存在健康隱患，研究[2]發現焦亞硫酸鈉會誘發人體哮喘、過敏反應且殘留的SO2與癌癥的發生有相關性。而半胱氨酸相比焦亞硫酸鈉，雖然沒有副作用，但價格昂貴，會大幅提高企業成本。酶制劑相比前兩者，價格適中，無副作用，符合市場清潔標簽的健康趨勢，具有明顯優勢。

關于酶制劑在餅干中的應用研究已有多年歷史，Kara等[3]曾發現蛋白酶可以提高曲奇餅干的延展性，減小其密度。陸曉濱等[4]發現中性蛋白酶可以降低韌性餅干的斷裂率。但目前針對不同酶制劑對餅干品質影響的對比研究以及機理探究較少。毛永甫等[5]曾探究過菠蘿蛋白酶與SMS對韌性面團的作用差異，發現蛋白酶在提升餅干的膨松度及折損強度方面的效果更優于焦亞硫酸鈉，但未對菠蘿蛋白酶與SMS改善餅干品質的機理進行比較研究。本試驗擬研究不同蛋白酶與SMS、CYS對餅干品質的影響差異，并通過測定面團流變特性、面筋蛋白分子量分布探究蛋白酶與化學添加劑改善餅干品質的機理，為酶制劑的應用推廣提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

低筋粉：益海嘉里有限責任公司公司；

大豆油、綿白糖：無錫歐尚超市；

木瓜蛋白酶：2 600 U/mg，重慶驕王天然產物股份有限公司；

菠蘿蛋白酶：240 U/mg，重慶驕王天然產物股份有限公司；

中性蛋白酶Neutrase 1.5 MG：150 U/mg，諾維信中國生物技術有限公司公司；

焦亞硫酸鈉：博宇化工有限公司；

半胱氨酸：廣州恩軒朗邦化工有限公司；

十二烷基硫酸鈉(SDS)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉：分析純，國藥化學試劑上海有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

壓面機：JMTD168型，北京東孚久恒儀器技術公司；

物性分析儀：TA.XTPlus型，英國SMS公司；

烤箱：BOD-102型，新麥機械(無錫)有限公司；

流變儀：DHR-3型，美國沃特世公司；

高效液相色譜儀：LC-20AT型，日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 餅干配方與制作方法

(1) 餅干配方：餅干配料見表1。

表1 餅干配料表Table 1 Biscuits’ Ingredients list g

(2) 餅干制作方法：稱取適量豆油、綿白糖、食鹽、小蘇打、碳酸氫銨、蛋白酶或化學添加劑(以粉基計)加入50 ℃溫水中，攪拌至完全溶解，加入面粉，和面1～2 min至揉勻成團，靜置30 min。依次調節延壓距離輥至4，3，2 mm，將面團壓至2 mm的面片，壓模，放入烤箱烘烤10 min。烤箱溫度為上火200 ℃，下火190 ℃。

1.2.2 酶處理小麥粉的制備 分別稱取20 mg蛋白酶或化學添加劑至50 ℃的40 mL水中，混合均勻，再加入100 g 面粉，揉成面團，靜置30 min后，冷凍干燥，磨成粉過100目篩備用。

1.2.3 餅干中二氧化硫殘留量的測定 按GB 5009.34—2016《食品中二氧化硫的測定》中第一法執行。

1.2.4 餅干特性的測定

(1) 餅干比容的測定：根據李娟[6]的方法修改如下，將餅干冷卻至室溫后，整齊疊加5片餅干，利用游標卡尺對高度、寬度、長度進行測量，測量3次取平均值，測出其體積。按式(1)計算比容。

(1)

式中：

SV——比容，cm3/g；

V——體積，cm3；

M——質量，g。

(2) 餅干質構的測定：根據賈瑜[7]的方法修改如下，將餅干冷卻至室溫后，用質構儀測定餅干硬度、脆性、酥性的變化。測定條件：TA探頭型號P/2；測試前、中、后速率分別為5.00，2.00，5.00 mm/s；感應力5 g。每個樣品至少重復3次取平均值。

1.2.5 餅干色度的測定 餅干烤制后在室溫下冷卻2 h，使用高精度分光測色儀測定。測定光源D65，色空間選用L*、a*、b*。每個樣品平行測定3次，結果取平均值。

1.2.6 面團流變特性的測定 分別取不同酶處理的面粉加水揉成面團備用。測試條件：探頭為P20 mm；板間距2 mm；應變0.1%；掃描頻率0.1～10.0 Hz。

1.2.7 小麥粉溶劑保留率(Solvent Retention Capacity, SRC)的測定 按AACCI(56-11.02，2010)執行。

1.2.8 面筋蛋白分子量分布測定 取10 mg凍干面團樣品溶于1 mL 2% SDS的PBS緩沖液(0.05 mol/L，pH 6.8)中，萃取3 h后離心(5 000×g，4 ℃，5 min)取上清液。色譜條件：分析柱為Shodex Protein KW-804，流動相為0.2% SDS的PBS緩沖液。上樣量20 μL，柱溫30 ℃，流速0.7 mL/min，檢測器為紫外檢測器，檢測波長214 nm[8]。

1.3 數據處理

差異顯著性分析用SPSS 18.0軟件，圖形使用Origin 8.5軟件分析，顯著性分析取P<0.05。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶對韌性餅干比容的影響

比容是評價餅干品質的重要指標。比容大，質地疏松，內部氣孔分布均勻是優質餅干的主要特征。由表2可知，隨著添加量的增加，各組餅干的比容都呈增大趨勢。在SMS與CYS對照組中，添加150 mg/kg SMS組的餅干比容值最大，相比空白組提高了32.5%。與化學添加劑的對照組相比，添加50 mg/kg的木瓜蛋白酶后，餅干比容即可達到2.22，相比空白提高了48.2%，超過添加SMS與CYS組的最大值。而在菠蘿蛋白酶組中，當添加量為250 mg/kg時，比容值不再發生明顯變化，為2.28，小于木瓜蛋白酶組，但優于化學添加劑的對照組。中性蛋白酶組的比容在350 mg/kg 添加量以前小于SMS組與CYS組，當添加量達到350 mg/kg 時，比容增大至2.20且大于SMS與CYS組。木瓜蛋白酶對于餅干比容的提升效果最明顯，達到與化學添加劑組相同比容時所需劑量更小，僅為SMS的1/3。基于SMS在餅干中的添加量存在限制，根據方法1.2.3測定餅干中的SO2殘留量發現，SMS添加量為350 mg/kg時，餅干中SO2殘留量超過GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》的限定值，但為了探究酶制劑改良餅干的最佳添加量，仍保留350 mg/kg 的SMS對照組，此劑量僅為試驗參考所需。

表2 蛋白酶和化學添加劑劑量對餅干比容的影響?Table 2 Effect of protease and chemical additives on specific volume with different dosages respectively

? SMS表示添加焦亞硫酸鈉的韌性餅干；CYS表示添加半胱氨酸的韌性餅干；PAP表示添加木瓜蛋白酶的韌性餅干；BRP表示添加菠蘿蛋白酶的韌性餅干；NEP表示添加中性蛋白酶的韌性餅干；同列不同字母表示組間存在顯著性差異(P<0.05)。

2.2 蛋白酶對韌性餅干質構的影響

餅干烘烤受熱時，添加的碳酸氫銨、小蘇打會受熱分解產生二氧化碳氣體，面筋形成的網絡結構能夠包裹這些氣體，使得餅干體積增大，高度增高[9]。然而面粉的筋力過強會導致面團過于緊實，限制餅干的膨脹，造成餅干體積過小，口感硬實。高品質的韌性餅干應具有較小的硬度以及酥松的口感[10]。選取硬度、脆性和酥性來表征餅干的質構參數[7]。不同劑量蛋白酶對餅干質構的影響見圖1。圖1表明，添加3種蛋白酶與化學添加劑后，隨著劑量的增加，餅干的硬度和脆性都呈明顯下降趨勢。一般來說，餅干的硬度越低，脆性越低，兩者具有相關性[7]。當添加量相同時，5組餅干的硬度從小到大分別是：PAP組

BC表示空白對照的韌性餅干；SMS表示添加焦亞硫酸鈉的韌性餅干；CYS表示添加半胱氨酸的韌性餅干；PAP表示添加木瓜蛋白酶的韌性餅干；BRP表示添加菠蘿蛋白酶的韌性餅干；NEP表示添加中性蛋白酶的韌性餅干

圖1 蛋白酶和化學添加劑劑量對餅干質構的影響

Figure 1 Effect of protease and chemical additives on texture with different dosages respectively

2.3 蛋白酶對餅干色度的影響

表3是蛋白酶與化學添加劑對餅干色度的影響，L為亮度(0為黑色，100為白色)，+a*為紅，-a*為綠，+b*為黃，-b*為藍[11]。在試驗所用添加量下，添加SMS后餅干的亮度與空白樣品無明顯差異。添加200 mg/kg NEP的亮度略高于其他試驗組。蛋白酶對餅干的紅綠值沒有明顯影響。添加了酶制劑與化學添加劑后，餅干的黃度都出現略微下降，添加BRP的試驗組黃度下降最多。總體上看，蛋白酶對餅干顏色的影響較小。

表3 蛋白酶與化學添加劑對餅干色度的影響?Table 3 Effect of protease and chemical additives on chroma of cookies

? BC表示空白對照的韌性餅干；SMS表示添加焦亞硫酸鈉的韌性餅干；CYS表示添加半胱氨酸的韌性餅干；PAP表示添加木瓜蛋白酶的韌性餅干；BRP表示添加菠蘿蛋白酶的韌性餅干；NEP表示添加中性蛋白酶的韌性餅干；同列不同字母表示組間存在顯著性差異(P<0.05)。

2.4 蛋白酶對面團流變特性的影響

面團的流變性能可在一定程度上決定產品的最終品質[12]。圖2、3描述了添加不同蛋白酶和化學添加劑后面團的G＇和G″隨振蕩頻率變化關系圖。貯能模量(G＇)和損耗模量(G″)為流變儀的2個主要參數值。G＇是指儲存在物質中的或經過一個震動周期的正弦形變后所恢復的能量，它代表物質的彈性本質。面團流變試驗結果表明，添加了3種蛋白酶后面團的G＇出現明顯下降，說明面團的彈性減小，面筋筋力弱化。而5組曲線中，添加PAP的面團值G＇最小，說明其弱化的程度最大。面團的筋力是影響餅干品質的重要因素，在一定范圍內，面團的筋力越小，對應餅干的比容越大，硬度和脆性越小，酥性越大，所得餅干的品質越好。Lefebvre等[13]認為面團的彈性與面筋蛋白中谷蛋白聚合體的含量存在正相關性，聚合度越高的谷蛋白其G＇也越高。添加蛋白酶后面團G＇值下降,說明面團中的谷蛋白聚合體含量下降。G″是指每個周期的正弦形變所消耗或損失的能量，它代表的是物質的黏性本質，故也稱黏性模量。G＇>G″，物體表現為固體性質；G＇

BC表示空白對照的韌性餅干；SMS表示添加焦亞硫酸鈉的韌性餅干；CYS表示添加半胱氨酸的韌性餅干；PAP表示添加木瓜蛋白酶的韌性餅干；BRP表示添加菠蘿蛋白酶的韌性餅干；NEP表示添加中性蛋白酶的韌性餅干

圖2 不同添加劑對面團G＇值的影響

Figure 2 Effect of different additives onG＇ in dough rheological properties

BC表示空白對照的韌性餅干；SMS表示添加焦亞硫酸鈉的韌性餅干；CYS表示添加半胱氨酸的韌性餅干；PAP表示添加木瓜蛋白酶的韌性餅干；BRP表示添加菠蘿蛋白酶的韌性餅干；NEP表示添加中性蛋白酶的韌性餅干

圖3 不同添加劑對面團G″值的影響

Figure 3 Effect of different additives onG″ in dough rheological properties

2.5 蛋白酶對小麥粉溶劑保留率(SRC)的影響

SRC值是指面粉的溶劑保留率，通過測定SRC值，可以有效地預測面粉的流變特性和產品品質特性[16]。由圖4可知，添加3種蛋白酶后面粉的水SRC值、碳酸鈉溶液SRC值都略微上升，蔗糖溶液SRC值下降，乳酸SRC值明顯下降。4種不同溶劑的SRC值中，乳酸SRC值的試驗組與空白組的差距最大。這是因為乳酸的 SRC值與面粉中麥谷蛋白的特性有關，谷蛋白含量越小，乳酸SRC值越小[17]。蛋白酶加入弱化了面筋結構，減少了面粉中谷蛋白聚合體的含量，導致乳酸的SRC值出現明顯下降。PAP組的乳酸SRC值最小，表明PAP酶解后小麥粉中的谷蛋白聚合體含量最小，該發現與前面流變試驗的趨勢一致。因此PAP弱化面筋的效果最明顯。碳酸鈉溶液SRC值與破損淀粉含量存在正相關，3組蛋白酶的碳酸鈉SRC值均出現上升，推測原因可能是蛋白酶破壞了淀粉表面的顆粒結合蛋白，使淀粉更容易損傷，導致碳酸鈉SRC值上升[18]。3組蛋白酶的水SRC值上升也能說明這一現象。水的SRC值代表面粉的吸水力，SRC值上升說明面粉吸水力變強。酶解小麥粉后，面粉中的谷蛋白聚合體含量下降，吸水力應減弱[19]。但面粉中淀粉表面的顆粒結合蛋白被破壞后會導致淀粉的吸水性增強[20]，因此宏觀表現為吸水力變強，面粉的水SRC值增大。

BC表示空白對照的韌性餅干；SMS表示添加焦亞硫酸鈉的韌性餅干；CYS表示添加半胱氨酸的韌性餅干；PAP表示添加木瓜蛋白酶的韌性餅干；BRP表示添加菠蘿蛋白酶的韌性餅干；NEP表示添加中性蛋白酶的韌性餅干

圖4 添加劑對面粉溶劑保留率的影響

Figure 4 Effect of different additives on flour solvent retention rate

2.6 蛋白酶對面筋蛋白分子量分布的影響

分子排阻色譜從分子量分布角度進一步說明了蛋白酶與化學添加劑對面筋蛋白的不同影響。分子排阻色譜能夠將面筋蛋白大致分為3個峰區，按分子量大小分別為谷蛋白聚合體(Mw為91 000～688 000)、單體谷蛋白與醇溶蛋白(Mw為16 000～91 000)和肽鏈及氨基酸(Mw<10 000)[21]。由圖5可以看出，添加了SMS與CYS的面團中，谷蛋白聚合體的含量較空白變化不明顯。而經過PAP酶解處理后的面團中，谷蛋白聚合體處的峰幾乎消失，肽鏈及氨基酸峰明顯增高，即面團中谷蛋白大分子聚合體的含量顯著減小，肽鏈及氨基酸等小分子含量增加。說明蛋白酶將面團中的谷蛋白大分子降解成為了分子量更小的肽鏈或氨基酸，從而降低了面團的彈性，使餅干不會收縮。而SMS與CYS的降解更可能是谷蛋白與醇溶蛋白之間的二硫鍵，對面團中谷蛋白聚合體的含量沒有明顯影響，與蛋白酶弱化面筋的方式存在本質差異[22]。

BC表示空白對照的韌性餅干；SMS表示添加焦亞硫酸鈉的韌性餅干；CYS表示添加半胱氨酸的韌性餅干；PAP表示添加木瓜蛋白酶的韌性餅干

圖5 添加劑對面筋蛋白分子量分布的影響

Figure 5 Effect of different additives on the molecular weight distribution of gluten protein

3 結論

蛋白酶PAP、BRP、NEP均能增大餅干比容、降低餅干的硬度與脆性，提高餅干的酥性，改善其質構，但對于餅干的色度則無顯著影響。當達到相同水平的比容大小與質構時，PAP的添加量為3種蛋白酶中最小，且小于SMS與CYS 2種化學添加劑。面團流變、面粉SRC值以及面筋蛋白分子量試驗發現蛋白酶與化學添加劑均使得面團的彈性下降，但蛋白酶使得面團中谷蛋白大分子聚合體的含量顯著減少，化學添加劑對其含量則無明顯影響，兩者弱化面筋的方式存在本質差異。本研究僅在蛋白分子分布角度對蛋白酶改善韌性餅干品質的機理做了探究，未來還可對其做進一步探討，例如研究谷蛋白大分子的具體含量與餅干品質的相關性。

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