黑茶茶褐素與茶多糖對脂肪酶的抑制作用

李祥龍 Xiang-long 李曉梅 - 楊 煦 唐 磊 許靖逸,2,3 -,2,3

(1. 四川農業大學園藝學院, 四川 成都 611830；2. 四川省茶業科學與工程重點實驗室, 四川 成都 611830；3. 四川省藏茶茶業工程技術研究中心, 四川 雅安 625014)

脂肪酶，又稱甘油酯水解酶，是水解脂肪的一類酶的總稱，隸屬于羧基酯水解酶類[1]。Chiesi等[2-3]的研究表明，脂肪酶與肥胖關系密切，利用脂肪酶抑制劑可有效抑制腸道中脂肪酶的活性，減少進入體內的脂肪代謝，影響體內脂肪的積累和合成，從而達到減肥的目的。

黑茶(Black Tea)屬于后發酵茶，是六大茶類中唯一一類有微生物參與其加工過程及品質形成的特殊茶類，主產于湖南、湖北、云南、四川、廣西等省(區)。黑茶是六大茶類中加工鮮葉原料最粗老的茶類，多采用四葉五葉、甚至修剪枝葉，其茶葉多糖的含量為六大茶類之首。研究發現，黑茶具有抗氧化[4]、抑菌和降脂減肥[5-6]等多種藥理功效，特別是其良好的降脂減肥功效已從細胞、動物和人體等多個方面得到證明，但其降脂減肥的功效成分及作用機理尚不清楚。茶褐素是黑茶中主要的色素類物質，也是重要的功能成分，由茶黃素和茶紅素進一步氧化而成，具有良好的降脂減肥功效[7-9]。茶多糖是從茶葉中提取的活性多糖的總稱，研究[10]發現，茶多糖具有降低游離脂肪酸的作用。目前，茶褐素和茶多糖對脂肪酶的抑制作用還未見報道，因此本試驗擬通過研究不同地區黑茶中茶褐素和茶多糖的降脂減肥功效，為黑茶的保健功效及其進一步開發利用提供科學依據，為尋找天然的降脂減肥材料提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

普洱茶(熟茶)：2014年，云南下關沱茶(集團)股份有限公司；

康磚：2014年，四川吉祥茶業有限公司；

茯磚：2014年，湖南省白沙溪茶廠股份有限公司；

六堡茶：2014年，廣西壯族自治區梧州茶廠；

脂肪酶(豬胰中提取，PPL，typeⅡ)：酶活力≥30 000 U/g，美國Sigma公司；

4-硝基苯基丁酸酯(p-NPB)、對硝基苯酚(p-NP)、二甲基亞砜(DMSO)、Tris、無水乙醇、95%乙醇、無水丙酮、無水乙醚、乙酸乙酯、三氯甲烷、正丁醇等：國產分析純；

水浴恒溫振蕩器：SHY-2A型，常州國宇儀器制造有限公司；

生化培養箱：SPX-250型，上海申賢恒溫設備廠；

高速冷凍離心機：2-16K型，美國Sigma公司；

紫外-可見分光光度計：UV-2300型，日本日立公司；

精密微量移液器：WKY III型，上海佳安分析儀器廠；

旋轉蒸發器：RE52-86A型，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配制

(1) 脂肪酶液配制：精確稱取0.500 0 g脂肪酶于研缽中，加少許Tris-HCl緩沖液(pH=8.0)研磨，定容至100 mL容量瓶中，靜置，4 ℃下12 000 r/min冷凍離心1 min，保存于-20 ℃冰箱中備用，即濃度為5 mg/mL的酶儲備液[11-12]。

(2) 底物配制：精確稱取一定量的p-NPB，用DMSO配置成濃度為0.01 mol/L的儲備液，置于-20 ℃冰箱中備用。

(3) 對硝基苯酚溶液配制：精確稱取一定量的p-NP，用DMSO配制成10 μmol/mL的溶液備用。

(4) 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH=8.0)配制：精確稱取6.057 5 g Tris溶于水，定容至250 mL；取25 mL Tris溶液加到含有25 mL 0.1 mol/L HCl的100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容。

1.2.2 黑茶茶褐素的制備 分別稱取黑茶茶樣各40 g，按1∶20 (g/mL)茶水比加入沸蒸餾水，浸提30 min，重復3次，合并浸提液，4層紗布過濾，所得濾液再抽濾，于旋轉蒸發儀減壓濃縮，得萃取液。萃取液用等體積正丁醇、氯仿、乙酸乙酯萃取3次，合并水相，減壓濃縮，干燥[13]。

采用系統比色法[14]檢測茶褐素含量。

1.2.3 黑茶茶多糖的制備 分別稱取茶樣20.0 g，粉碎，在茶水比1∶20 (g/mL)，溫度70 ℃的條件下，浸提30 min，趁熱抽濾，重復浸提3次，合并濾液，于旋轉蒸發儀減壓濃縮至原體積的20%。將濃縮后的茶湯與3倍體積95%的乙醇混合沉淀1 h，再于7 000 r/min離心5 min，得到沉淀物用無水乙醇、丙酮、乙醚交替洗滌2次，并在70 ℃下真空干燥[15]。

采用蒽酮-硫酸比色法[16]測茶多糖含量。

1.2.4 脂肪酶活性測定 取6支試管，分別加入10 μmol/mL 對硝基苯酚1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，用DMSO補充到5 mL，以未加對硝基苯酚的空白溶液作對照，在405 nm 波長處測吸光度，以吸光度值為縱坐標，對硝基苯酚濃度為橫坐標，得到對硝基苯酚的標準曲線[17-18]。

將0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH=8.0) 2 100 μL、酶液300 μL置于37 ℃恒溫箱內預熱15 min，然后將其注入100 μL底物溶液中，搖床15 min，立即加入無水乙醇5 mL終止反應，以未加脂肪酶的空白溶液為參照，在405 nm波長處測其吸光度值。對照對硝基苯酚標準曲線，即可求得對硝基苯酚的濃度。

脂肪酶活力單位定義為：在一定條件下，每分鐘釋放出1 μmoL 對硝基苯酚的酶量定義為一個酶活力單位(U)。計算公式：

(1)

式中：

X——脂肪酶活力，U/mL；

c——對硝基苯酚的濃度，μmoL/mL；

V——反應液終體積，mL；

t——反應時間，min；

V′——酶液用量，mL。

脂肪酶抑制率的測定按照上述脂肪酶活力的測定方法，先加入定量的Tris-HCl緩沖液(pH=8.0)、茶褐素(茶多糖)和脂肪酶液，預熱，再加入底物溶液，終止反應，測定剩余酶活性，按式(2)計算抑制率。

(2)

式中：

I——抑制率，%；

X——脂肪酶活力，U/mL；

X′——抑制后酶活力，U/mL。

1.2.5 半抑制濃度的測定 測定各黑茶茶褐素(茶多糖)濃度在0.00，1.25，2.50，5.00，10.00，20.00，40.00，80.00 mg/mL時對脂肪酶的抑制率，以各黑茶茶褐素(茶多糖)濃度為橫坐標，脂肪酶抑制率為縱坐標，作回歸曲線，得出半抑制濃度IC50。半抑制濃度越小，抑制能力越強。

1.2.6 脂肪酶抑制動力學的測定 在無抑制劑和適宜濃度的各黑茶茶褐素(茶多糖)條件下，加入一定量質量濃度為0，2，3，4，5 mg/mL酶溶液，按照上述酶活測定方法測定吸光度，計算反應速率。按Dixon作圖法，以反應速率對脂肪酶濃度作圖，確定抑制類型[19-20]。

將各黑茶茶褐素(茶多糖)稀釋至一定的濃度，分別取300 μL 加入至300 μL酶液中，然后將其加入至底物濃度分別為0.001，0.002，0.003，0.004 mmol/L反應體系中，測定酶反應速度。采用Lineweaver-Burk雙倒數法，將1/V對1/[S]作圖，測定各黑茶茶褐素(茶多糖)對脂肪酶的可逆抑制作用類型。

1.3 數據記錄與處理

試驗數據采用Excel和SPSS 17.0 軟件對數據進行統計處理，所有數據均以均數±標準差 (SE)表示，不同組間的比較采用LSD法進行方差分析，檢驗水平a=0.05。

2 結果與分析

2.1 受試茶樣主要理化成分含量及分析

由表1可知，經過渥堆發酵的4種黑茶中，茯磚茶的多酚類含量最高，為13.96%，其次為康磚，六堡茶和普洱茶的多酚類含量相對較低。通過對茶色素含量的對比分析，表明茯磚茶的茶黃素和茶紅素含量分別為0.29%和1.02%，顯著高于其他3種；但茶褐素僅為3.17%，顯著低于普洱茶(8.17%)和六堡茶(5.91%)。根據這3個主要指標的測定結果，可得出茯磚茶渥堆發酵程度最輕，而普洱茶和六堡茶渥堆發酵程度最重。

2.2 各黑茶茶褐素與茶多糖對脂肪酶活性的影響

在不同濃度的對硝基苯酚溶液下，以不加對硝基苯酚的空白溶液作為對照，得到對硝基苯酚標準曲線為y=0.063 7x-0.018 5，R2=0.999 5。

按照1.2.5所示的脂肪酶的半抑制濃度的測定方法，分別測定普洱茶(熟茶)、六堡茶、茯磚和康磚的茶褐素與茶多糖在濃度梯度為0.00，1.25，2.50，5.00，10.00，20.00，40.00，60.00，80.00 mg/mL條件下對脂肪酶抑制效果，結果見圖2。

表1 受試茶樣主要理化成分含量結果?Table 1 Results of main physical and chemical components in tea samples (n=4) %

? 同列小寫字母表示0.05顯著水平。

圖1 各黑茶不同濃度的茶褐素與茶多糖對脂肪酶活性的影響Figure 1 Effects of different concentrations of tea theabrownin and tea polysaccharide on lipase activity in different black tea

由圖1、表2可知，不同黑茶的茶褐素與茶多糖對脂肪酶活性均存在一定抑制作用，且隨茶褐素與茶多糖濃度的增加，在一定濃度范圍內對脂肪酶的抑制作用呈上升趨勢。各黑茶茶褐素抑制脂肪酶活性以普洱茶褐素IC50最小，為25.96 mg/mL，抑制作用最強；茯磚的茶褐素IC50最大，為57.08 mg/mL，抑制作用最小。各黑茶茶多糖對脂肪酶活性抑制作用表現為：普洱茶茶多糖IC50最小，為47.57 mg/mL，抑制效果最好；茯磚茶多糖IC50最大，為662.44 mg/mL，抑制效果最差。

表2各黑茶茶褐素與茶多糖對抑制脂肪酶活性的IC50?

Table 2 Inhibition of lipase activity by tea theabrownin and tea polysaccharide onIC50mg/mL

? 同列小寫字母表示0.05顯著水平。

2.3 不同黑茶茶褐素與茶多糖對脂肪酶的抑制作用

由圖2可知，普洱茶、六堡茶、茯磚茶、康磚茶中存在的茶褐素對脂肪酶均有抑制作用，且抑制類型均為可逆抑制。劉睿等[21]通過在酶活測定體系中加入定量的抑制劑，以不同酶濃度測定酶活力，以酶濃度為橫坐標，反應速率為縱坐標作圖發現，體系中無抑制劑，該直線通過原點；當體系中存在一定量可逆抑制劑時，亦可得一條斜率相對較低且過原點的直線。各黑茶茶多糖對脂肪酶的抑制類型如圖3所示，結果表明普洱茶(熟茶)、六堡茶、茯磚茶與康磚茶中的茶多糖均對脂肪酶有抑制作用，且這種抑制作用類型均為可逆抑制。

2.4 黑茶茶褐素與茶多糖對脂肪酶的可逆性抑制類型

圖4為各黑茶茶褐素對脂肪酶的可逆抑制雙倒數Lineweaver-Burk作圖結果。在Lineweaver-Burk圖中，直線交于橫軸為非競爭性抑制，交于縱軸為競爭性抑制，交于第二象限為競爭性與非競爭性混合抑制[22]。普洱茶、六堡茶、茯磚、康磚的茶褐素濃度為2.5，5.0 mg/mL時，直線均交于第二象限，通過對比，可以看出圖4(b)、(c)的直線交點比其他2個更靠近縱軸，說明其抑制類型為競爭性與非競爭性混合抑制，接近于競爭性抑制作用；而圖4(a)、(d)直線的交點稍遠于縱軸，說明抑制類型為典型的競爭性與非競爭性混合抑制。

通過對比可以看出圖5(b)、(d)的直線均交于第二象限，表明其抑制類型為競爭性與非競爭性混合型抑制作用；圖5(a)的直線交于第二象限且直線交點靠近縱軸，說明其抑制類型為競爭性與非競爭性混合型抑制，接近于競爭性抑制類型；圖5(c)中，該組直線相交于縱軸，表明其為競爭性抑制類型。

3 結論

(1) 4種黑茶中普洱茶、六堡茶的渥堆發酵程度最重，茯磚茶的渥堆發酵程度最輕，康磚茶居中。通過各黑茶IC50的比較分析可知，普洱茶(熟茶)減肥降脂效果最好，六堡茶次之，茯磚最差，康磚介于六堡茶和茯磚之間。

圖2 黑茶茶褐素對脂肪酶的抑制作用Figure 2 Inhibitory effect of different black tea theabrownin on lipase

圖3 黑茶茶多糖對脂肪酶的抑制作用Figure 3 Inhibitory effect of different black tea polysaccharide on lipase

圖4 黑茶茶褐素對脂肪酶的可逆抑制類型Figure 4 The reversible inhibition type of the different black tea theabrownin on lipase

圖5 黑茶茶多糖對脂肪酶的可逆抑制類型Figure 5 The reversible inhibition type of the different black tea polysaccharide on lipase

(2) 4種黑茶茶褐素作用于脂肪酶的抑制類型為競爭性與非競爭性混合型，其中六堡茶接近于競爭性抑制類型。普洱茶、六堡茶與康磚茶多糖的抑制類型為競爭性與非競爭性混合型，其中普洱茶接近于競爭性抑制類型，而茯磚茶為競爭性抑制類型。

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