茶黃素抗氧化化學機制研究

謝 虹XIE Hong 羅志聰 - 李熙燦 -

(廣州中醫藥大學中藥學院，廣東 廣州 510006)

紅茶是一種全發酵型茶類，因其香氣甜純、滋味濃厚而廣泛受到世界消費者的喜愛。茶黃素(圖1)是紅茶在發酵過程中，由簡單兒茶素類聚合而成的黃烷醇類化合物[1]，是衡量紅茶品質的重要因素。現代藥理學研究表明，茶黃素有顯著的抗腫瘤[2]、抗炎[3]、抗氧化作用[4-5]，是紅茶發揮保健作用的重要物質基礎。陳虎等[6]認為茶黃素能調節體內生物酶系的活性、防止低密度脂蛋白的氧化，修復生物系統的氧化損傷。最新的研究[7-8]還表明，茶黃素能通過hedgehog或Shh等信號通路限制肝的瘤變。但這些研究側重闡明其抗氧化的生物機制，沒有涉及化學機制。

本研究采用化學模式，研究茶黃素清除各種自由基的清除活性。在此基礎上，進一步討論其機制，以闡釋茶黃素體內抗氧化的化學本質。

圖1 茶黃素的結構式Figure 1 Structure of theaflavin

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

茶黃素(CAS：4670-5-7)：HPLC≥98%，四川省維克奇生物科技有限公司；

新銅試劑、DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基、Trolox：HPLC≥98%，西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；

(NH4)2ABTS [2,2’-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽]：美國Amresco公司；

K2S2O8、CuSO4、CH3COONH4、95%乙醇：AR級，廣州化學試劑廠。

1.1.2 儀器設備

紫外-可見分光光度計：UV2100型，上海尤尼柯儀器有限公司；

電子天平：BS110S型，北京賽多利斯天平有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 DPPH·清除能力的測定 依據文獻[9]并做適量修改。稱取1 mg DPPH，加入95%乙醇20 mL，超聲使之完全溶解。取溶解后的DPPH·溶液1 mL與95%乙醇500 μL混合，利用紫外分光光度計在519 nm下測吸光度(A0)值。取該DPPH·溶液1 mL分別與20，40，60，80，100 μL的茶黃素溶液(0.1 mg/mL)混合，再向其中分別加入480，460，440，420，400 μL的95%乙醇使之總體積為1.5 mL，靜置30 min 后，在519 nm下測吸光度值。平行測定3次。以Trolox(0.1 mg/mL)為陽性對照。樣品清除DPPH·的能力按式(1)計算：

(1)

式中：

R——自由基清除率，%；

A0——未加樣品液時所測吸光度值；

A——加入樣品液時所測吸光度值。

1.2.2 ABTS+·清除能力的測定 依據文獻[10]并做適量修改。取7.4 mmol/L (NH4)2ABTS溶液和2.6 mmol/L K2S2O8溶液各1 mL混合，在室溫避光下放置12 h，使之反應完全。用95%乙醇稀釋此ABTS+·工作液，利用紫外分光光度計在734 nm下測A0值，調整A0至(0.7±0.02)。取該ABTS+·工作液800 μL，加茶黃素(0.025 mg/mL)xμL(x=15，30，45，60，75)，再加95%乙醇(200-x) μL，振搖10 s 以充分混合，然后在734 nm下測定吸光度值，平行檢測3次。以Trolox (0.025 mg/mL)標準品為陽性對照。樣品清除ABTS+·的能力按式(1)計算。

1.2.3 Cu2+還原能力的測定 依據文獻[11]并做適量修改。取0.01 mol/L CuSO4溶液和7.5 mmol/L新銅試劑各125 μL混勻，依次加入茶黃素(0.1 mg/mL)xμL(x=15，30，45，60，75，90)、CH3COONH4緩沖液(700-x) μL，混合，靜置30 min，于450 nm處測吸光度值，平行檢測3次。以Trolox (0.1 mg/mL)標準品為陽性對照。樣品Cu2+還原能力按式(2)計算：

(2)

式中：

S——Cu2+的相對還原率，%；

A0——未加樣品液時所測吸光度值；

Amax——一次測量內最大的吸光度值；

A——加入樣品液時所測吸光度值。

1.2.4 數據分析 每個樣品重復3次試驗，試驗結果以平均值±標準差表示，采用SPSS 13.0對數據進行t檢驗。P<0.05 表示具有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 DPPH自由基清除活性及機制

DPPH自由基是一種以N為中心的穩定自由基，由于其分子中存在多個吸電子的—NO2和苯環的大π鍵，所以氮自由基能穩定存在[12]。DPPH自由基的乙醇溶液為深紫色，其在517 nm處有強吸收。若與樣品混合，反應液的顏色變淡，同時在517 nm下吸光度值減少，據此可以判斷樣品清除DPPH自由基的能力[13]。從圖2中可以看出，在0～6 μg/mL 的濃度范圍內，茶黃素清除DPPH·的能力逐漸增加，并且表現出良好的量效關系。其IC50=(7.7±0.1) μmol/L，小于Trolox的(見表1)，說明茶黃素清除DPPH·的能力強于Trolox。此前的文獻[14]認為，氫原子轉移(hydrogen atom transfer，HAT)是DPPH·清除涉及到的一種重要機制，活潑的DPPH·接受了一個氫原子后形成了穩定的DPPH—H分子。因此，DPPH·清除模型可以用來衡量抗氧化劑的HAT能力[15]。

依據文獻[16]，茶黃素分子與DPPH·發生的反應，可表示為圖3。在反應中，茶黃素上的鄰二酚羥基(O—H鍵)發生均裂，失去H·后形成茶黃素自由基(I)，H·與DPPH· 結合生成穩定的DPPH—H分子。茶黃素自由基(I)，進一步轉化為更穩定的鄰苯醌式產物(II)。不難看出，正是鄰苯醌式產物的穩定性，導致了茶黃素分子的強抗氧化活性。因此，茶黃素發揮其體外抗氧化作用可能與其具有的HAT能力有關。值得一提的是，茶黃素的鄰苯醌式產物多存在于環狀化合物，鏈狀化合物由于不具有環狀結構，無法轉變為醌式結構，所以大多不表現出抗氧化活性(如十六酸)[17]。

表1 茶黃素和Trolox在各種抗氧化分析法中的IC50值?Table 1 The IC50 values of theaflavin and Trolox in several antioxidant assays

?IC50值是指當自由基的清除率為50%時樣品的濃度；同行不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

圖2 茶黃素和Trolox的DPPH自由基清除率曲線Figure 2 The dose response curves of theaflavin and Trolox in DPPH·-scavenging assay

圖3 茶黃素與DPPH·可能發生的反應式Figure 3 The proposed reaction of theaflavin with DPPH·

2.2 ABTS自由基清除活性及機制

ABTS法是一種經典的檢測物質抗氧化能力的方法[18]，適用于天然的或合成的抗氧化劑[19]。(NH4)2ABTS與K2S2O8反應可以生成穩定的ABTS+·自由基，此自由基呈深綠色，在734 nm處有最大吸收。如果ABTS+·被樣品清除，其734 nm的吸光度值會降低，顏色變淺。據此，可以來判斷樣品清除ABTS+·的能力[20]。從圖4中可以看出，在0～2 μg/mL的濃度范圍內，茶黃素清除ABTS+·的能力與其濃度形成良好的量效關系。其IC50值為(2.3±0.1) μmol/L，小于Trolox的(見表1)，說明茶黃素清除ABTS+·的能力強于Trolox。通常認為ABTS+·被清除的機制是電子轉移(ET)的過程(ABTS+· +e→ ABTS)[21]。據此推測，茶黃素有較強的ABTS+·清除能力，其清除過程至少包括ET機制。

2.3 Cu2+還原能力及機制

抗氧化劑對金屬離子的還原能力，也可用于衡量其活性強弱[22]。從圖5中可以看出，在0～90 μg/mL的質量濃度范圍內，茶黃素對銅離子的相對還原率與濃度呈現出良好的線性關系。其IC50=(9.2±0.2) μmol/L，小于Trolox的(見表1)，表明茶黃素還原Cu2+的能力強于Trolox。文獻[20]表明，Cu2+被還原成Cu+是電子轉移的過程。這進一步印證了茶黃素具有ET能力的推測。

圖4 茶黃素和Trolox的ABTS+·清除率曲線

Figure 4 The dose response curves of theaflavin and Trolox in ABTS+·-scavenging assay

圖5 茶黃素和Trolox 的相對Cu2+還原能力濃度曲線

Figure 5 The dose response curves of theaflavin and Trolox in Cu2+-reducing assay

3 結論

作為一種存在于紅茶中的天然抗氧化劑，茶黃素在DPPH自由基清除、ABTS清除、Cu2+還原力3個方面，其活性均明顯強于Trolox。它的抗氧化作用可能涉及氫原子轉移(HAT)和電子轉移(ET)。并且通過HAT機制，茶黃素可轉化為穩定的鄰苯醌式產物。此研究闡明了茶黃素抗氧化的化學機制，有助于理解抗氧化活性與結構的關系，為茶黃素類衍生物的開發利用提供理論基礎。但該試驗對于茶黃素所涉及的化學機制研究尚不全面，仍有待進一步分析完善。

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