β-內啡肽基因在小鼠體內表達的生物效應研究

李星 ，白光明 *，萬小平 *，程馳 ，李江淩 ，呂學斌 ，王澤洲 ，高榮 **

（1.四川大學生命科學學院，生物資源與生態環境教育部重點實驗室，四川省動物疫病預防與食品安全重點實驗室，四川 成都 610064；2.四川理工學院生物工程系，四川 自貢 643000；3.四川省畜牧科學研究院，四川 成都 610066；4.四川省動物疫病預防控制中心，四川 成都 610041）

β-內啡肽（β-endorphin，EP）由 31個氨基酸組成，可由動物下丘腦-垂體自身合成[1]。通常情況下僅少量釋放到血液中，在應激情況下釋放入血增多，發揮重要的抗應激和抑制疼痛的效應[2]。近來發現，免疫系統也能夠產生β-內啡肽，主要是外周血單個核細胞（PBMC）合成的，PBMC主要包括單核細胞和淋巴細胞，其中T型記憶細胞中β-內啡肽含量比較高。在炎癥或者應激情況下，PBMC中的β-內啡肽含量會顯著升高，然而血漿中的β-內啡肽含量并未發生變化。有研究表明淋巴結中的β-內啡肽含量要顯著高于血漿，說明β-內啡肽在免疫細胞中合成后被送到淋巴結中[3]。β-內啡肽是由促阿黑皮素原的前體POMC加工形成的，曾在免疫細胞中發現有全長表達的mRNA，只是mRNA要比垂體中的mRNA短約200 bp，并且沒有信號肽序列。說明β-內啡肽在PBMC中的分泌形式同細胞因子十分相同，不需要信號肽前體就能分泌釋放[4]。小鼠的下丘腦中很多β-內啡肽都具有生物學活性[5]。

對于β-內啡肽在免疫方面的作用有很多報道，效應不一，主要表現為抑制作用。動物生產和運輸中，動物的應激不僅導致其生長和生產性能下降，而且持續的應激可造成免疫抑制，降低抗病能力，容易感染病原發病；同時減弱動物對疫苗的免疫應答，致使其免疫保護力降低、保護期縮短。除傳統的飼養管理措施和化學藥物外，目前迫切需要新技術來控制或減少動物應激發生，因此，本研究進一步探索了β-內啡肽的生物學效應。我們利用殼聚糖及其修飾分子包裹β-內啡肽重組基因質粒，制備納米顆粒劑肌肉注射實驗小鼠，同時用重組畢赤酵母菌進行灌胃口服，比較探索β-內啡肽基因在小鼠體內表達的抗應激和免疫生物活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 真核載體質粒、畢赤酵母和實驗動物 β-內啡肽基因（EP）的重組VR1020表達質粒-VREP：由四川大學生命科學學院實驗室構建；VR1020：真核表達質粒，美國Vical公司提供，由本單位實驗室保存；β-內啡肽基因的重組酵母表達載體pGAPZαA-EP：由四川大學生命科學學院實驗室構建；3周齡18～20 g健康雌性昆明小白鼠：由四川省人民醫院實驗動物中心提供。

1.1.2 試劑 Fluorescein isothiocyanate（FITC）antimouse CD4 和 Phycoerythrin（PE） anti-mouse CD8a（Lγ-2）：均購于 eBioscience公司；多聚磷酸鈉：購自天津市海晶精細化工廠；IgG、IgG1、IgG2a ELISA試劑盒：購自R&D公司；EDTA-K2：購自科龍試劑公司。1.1.3 包裹用納米材料 殼聚糖（CS，MW：15KD，脫乙酰度95%）：購自Sigma-Alorich公司；mPEG-PEICS（聚乙二醇和乙烯亞胺修飾的殼聚糖分子）：由四川大學化學學院李瑛老師于實驗室合成。

1.2 方法

1.2.1 質粒DNA的大量制備 真核重組大提質粒大提具體步驟（參照Omega無內毒素質粒大提試劑盒）：內毒素檢測依據鱟試劑凝膠法說明書進行。重組質粒和VR1020質粒的內毒素含量均低于標準值（0.1E/mg）。

1.2.2 納米顆粒的制備 用離子交聯法制備質粒DNA殼聚糖納米顆粒[6]。

1.2.3 畢赤酵母菌體準備 接種已構建正確的含有重組質粒pGAPZαA和 pGAPZαA-EP的畢赤酵母至YPD培養基中，30℃、220 r/min培養36 h，室溫下4000r/min離心5min，用新鮮培養基重懸菌體，調節菌液濃度至每0.3mL菌液含108個酵母細胞。

1.2.4 實驗動物分組 將50只18～20g的3周齡雌性昆明小白鼠隨機分成5組，每組10只。分組及處理見表1。

表1 實驗小鼠分組及處理

1.2.5 小鼠外周血免疫細胞數量測定 注射納米顆粒及灌胃之前首次采血，注射及灌胃后每周固定時間采尾靜脈血一次，用血球自動計數儀進行血常規檢測。

1.2.6 EP對小鼠生長的影響 50只小鼠分組后，試驗前分別稱取每組小鼠的體重，以后每周固定時間稱取小鼠體重，觀察小鼠生長變化。

1.2.7 CD4+、CD8+T細胞的檢測 免疫后14d、28d采集實驗小鼠尾靜脈抗凝血，用以檢測CD4+、CD8+T細胞亞群的變化。每組分別加入FITC和PE分子標記的大鼠抗小鼠CD4+、CD8+T單克隆抗體。用Coulter流式細胞儀分析小鼠血液CD4+、CD8+T細胞群的變化。

1.2.8 免疫小鼠血清IgG、IgG1、IgG2a含量的測定 小鼠免疫前及免疫后每周自尾靜脈采血，采用雙抗體夾心法ELISA試劑盒測定小鼠外周血血清中的IgG、IgG1、IgG2a、β-內啡肽以及皮質醇的含量。

1.2.9 免疫相關基因的定量PCR檢測 免疫相關基因的定量PCR表達分析用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀進行。以免疫小鼠血細胞cDNA為模板，根據表2中的定量引物進行擴增。

表2 免疫相關基因的擴增引物

所得的試驗數據均用方差分析進行差異顯著性比較，以P＜0.05為差異顯著性標準。

2 結果

2.1 納米顆粒的形態、粒徑及Zeta電位 4種納米顆粒在SEM觀察并拍照，納米顆粒大小與預期相同。SEM圖片見圖1、圖2。

利用Zeta sizer分析儀檢測納米顆粒的粒徑及Zeta電位，得出納米顆粒平均粒徑大小均在100～230nm之間，其中所有的納米顆粒都帶正電荷，合乎轉染細胞表達基因的要求。

2.2 凝膠阻滯分析 用材料CS、mPEG-PEI-CS包裹質粒VREP，形成的納米顆粒利用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示：包裹好的納米顆粒完全阻滯在點樣孔，沒有溢出。說明質粒已被殼聚糖分子充分包裹形成了納米顆粒。

2.3 小鼠體重變化情況 試驗前、后每周采血前定時稱量小鼠體重，觀察生長變化情況。由圖3可知：第7d～21d，注射 VREP-CS、VREP-PEG-PEI-CS 的小鼠的生長速度顯著高于對照組（P＜0.05），28d后這兩組小鼠的生長速度逐漸減緩，35 d時這兩組小鼠的體重與對照組差異不顯著（P＞0.05）。說明注射組小鼠在試驗前期的進食量可能要高于對照組，這與β-內啡肽能夠在短期內增加食欲的作用是一致的。而酵母口服試驗組和對照組小鼠的體重差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 VREP-CS約 100～200nm

圖2 VREP-mPEG-PEI-CS約 50～100nm

圖3 實驗小鼠免疫后體重的變化情況

2.4 CD4+、CD8+T細胞亞群的數量變化 用流式細胞儀分析小鼠血液中CD4+、CD8+T淋巴細胞的比例變化。由圖4可知：免疫后14d和28d，注射VREPCS、VREP-PEG-PEI-CS納米顆粒的試驗組及酵母口服組的CD4+、CD8+T淋巴細胞比例與對照組相比均有顯著增加（P＜0.05）；但此期注射VR1020裸質粒和口服酵母空載體，這兩組小鼠的CD4+、CD8+T淋巴細胞所占比例差異不顯著（P＞0.05）。

圖4 小鼠CD4+、CD8+T細胞含量變化

2.5 IgG、IgG1、IgG2a含量測定 由圖5可知：從第7 d到28d，注射組免疫小鼠的血清IgG含量均較對照組小鼠有明顯升高（P＜0.05）；從第7 d開始，口服組小鼠的血清IgG含量與對照組相比均有明顯升高（P＜0.05），說明試驗組小鼠的體液免疫水平較對照組顯著提高。從第7d到35d，所有小鼠的血清IgG1、IgG2a含量與對照組相比均無明顯上升（P＞0.05）。

2.6 免疫小鼠血清β-內啡肽含量測定 β-內啡肽是免疫系統應答和應激的介質[7]。由圖6可知：實驗小鼠從第7d到21d，血清中的β-內啡肽含量逐漸增加，與對照組差異顯著（P＜0.05）；第 21d后，試驗組與對照組的差異逐漸縮小。說明體內β-內啡肽含量從第0d開始逐漸增加，第21d時達到最高峰，之后又逐漸減少，可能是接種質粒的表達效應減弱所致。

2.7 免疫小鼠血清皮質醇含量測定 機體內很多激素類物質通常能夠客觀地反映應激對機體的影響程度，應激情況下機體的生理反應通常表現在體內皮質醇含量增加[8]。由圖7可知：第14d時，注射VREPCS、VREP-PEG-PEI-CS的免疫小鼠，其血清中的皮質醇含量最高，其余時期皮質醇含量與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。

圖5 實驗小鼠血清IgG、IgG1、IgG2a含量變化

2.8 免疫相關基因表達水平的變化 試驗測得：接種后 7d 開始，TLR1、TLR4、TLR6、TLR9、TGF-β、IL-1、IL-23這7種基因的表達水平相比對照組均有顯著提高（P＜0.05）（重組質粒組7d和mPEG-PEI-CS組的IL-1例外），說明接種重組質粒及重組酵母菌均能激發這幾種基因的表達。除TLR6外，其他6種基因的表達量均在免疫后21d達到最高峰；而TLR6基因在免疫后7d達到最高表達量，之后逐漸降低。

圖6 實驗小鼠血清β-內啡肽含量變化

圖7 實驗小鼠血清皮質醇含量變化

4 結論與分析

相關研究表明，β-內啡肽對免疫系統有抑制作用。阿片肽受體拮抗物——納洛酮和納曲酮能夠增強NK細胞的活性，絲裂原能誘導外周血單核細胞以及脾細胞在幾分鐘之內出現增殖反應[9]。阿片肽受體拮抗物還能使實驗性過敏性腦脊髓炎的病情惡化，然而外界應激刺激在增加外周血單核細胞中β-內啡肽含量的同時，卻能夠抑制該病情的進一步惡化[10]。

本試驗利用殼聚糖改性分子包裝質粒VREP，肌肉注射小鼠，并利用重組酵母菌灌胃小鼠，結果發現注射組和口服組小鼠均能在短期內增加食欲，進而增加體重；對小鼠外周血中的白細胞、血小板、紅細胞及血紅蛋白的含量影響不顯著（P＞0.05）；試驗組小鼠血清中的IgG含量顯著升高，IgG1和IgG2a含量與對照組差異不顯著（P＞0.05）；接種小鼠從第7d到21d，血清中的β-內啡肽含量較對照小鼠明顯增加，體內β-內啡肽含量的升高，反映其抗應激能力增強，且這些小鼠均未觀察到任何局部病變或炎癥損傷。由此說明試驗組的體液免疫水平明顯上升，抗應激能力提高；且重組質粒注射或重組酵母口服均對動物無不良影響。

Toll樣受體（TLR）、IL-23、TGF-β 在啟動抗微生物病原體免疫反應，促進炎癥組織修復、細胞生長分化以及免疫調節等方面起著關鍵作用。免疫后7d開始，重組質粒納米顆粒及重組酵母菌會激發7種免疫相關基因的表達，使其表達水平相對于接種前均顯著提高（P＜0.05），提示接種后產生了較好的先天性免疫和獲得性免疫增強效應。

總之，本試驗表明β-內啡肽基因重組質粒納米顆粒和重組酵母菌可提高實驗小鼠的細胞免疫和體液免疫水平，增強機體抗應激能力。這為進一步探索β-內啡肽在動物抗應激及其免疫調節中的作用奠定了基礎，也為研發安全高效的抗應激生物制劑提供了新的科學依據，在商業化應用方面具有潛在價值。

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