孜然乙醇提取物的工藝優化 及對酪氨酸酶活性的抑制作用

王 雅,杜國英,鄒紅梅,馬敏倩

(蘭州理工大學生命科學與工程學院,甘肅蘭州 730050)

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1),是一種含銅的氧化還原酶,廣泛分布于生物體內。酪氨酸酶在黑色素生物合成的過程中起第一限速酶和第三功能酶的作用,是黑色素合成的關鍵酶。它主要參與反應過程:催化L-酪氨酸轉變為L-多巴和將L-多巴氧化為多巴醌,再通過一系列的反應形成黑色素[1-2]。酪氨酸酶活性的大小與生成黑色素的量成正比[3]。因此,酪氨酸酶在皮膚增白方面具有很大的研究價值。孜然(CuminumcyminumL.),又名孜然芹、安息孜然、枯茗等。屬于一年或兩年生的傘形科孜然芹屬植物,是亞洲、非洲和歐洲傳統的中草藥和調味料之一,具有較高的藥用和食用價值,在我國主要分布于新疆[4]。目前,國內外研究發現孜然具有降血糖、抑菌、抗氧化[5-7]等生物活性。但關于孜然抑制酪氨酸酶活性方面的研究鮮有報道。

本文在單因素實驗的基礎上,以響應面法優化孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶的提取工藝,并研究了各極性部位對酪氨酸酶的抑制效果及主要活性成分的含量,以期為孜然抑制酪氨酸酶活性的作用機理和將孜然開發為皮膚美白劑提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

孜然 蘭州黃河藥材市場;L-酪氨酸、蘑菇酪氨酸酶(≥1000 U/mg)、Folin-Ciocalteu試劑、蘆丁、薯蕷皂苷元、葡萄糖 Sigma-Aldrich公司;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 天津天新精細化工開發中心;其他試劑 均為國產分析純。

DNM-9602酶標分析儀 北京普朗新技術有限公司;Scientz-N 真空冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司;L-550/L550臺式低速離心機 長沙湘儀離心機有限公司;DHP-9082電熱恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;752N紫外-可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 孜然乙醇提取物的制備 孜然經粉碎后過60目篩,稱取5.00 g的孜然粉末,按設定的液料比、乙醇體積分數、提取時間和提取溫度回流提取后,離心,收集上清液,減壓濃縮,冷凍干燥,備用。

1.2.2 酪氨酸酶抑制活性的測定 參考文獻[8]的方法,并稍作修改。吸取80 μL的樣品溶液(0.8 mg/mL)加到96孔酶標板中,再加入預先在37 ℃保溫的100 μL的L-酪氨酸溶液(2 mmol/L),振蕩混勻,在37 ℃恒溫箱中放置10 min后,加入40 μL的酪氨酸酶溶液(40 μg/mL),混勻繼續在37 ℃反應10 min,然后迅速用酶標儀測定492 nm處的吸光度AC1,AC2,AT1,AT2,按下式計算樣品對酪氨酸酶活性的抑制率:

式中,AC1為未加樣品的加酶混合液在492 nm處的吸光度值;AC2為未加樣品和酶的混合液在492 nm處的吸光度值;AT1為加樣品和酶的混合液在492 nm處的吸光度值;AT2為加樣品而未加酶的混合液在492 nm處的吸光度值。

1.2.3 孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的單因素實驗

1.2.3.1 乙醇體積分數的選擇 液料比為20∶1 (mL/g),提取時間為1.5 h,提取溫度為80 ℃,考察不同乙醇體積分數(50%、60%、70%、80%、90%)對孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的影響。

1.2.3.2 液料比的選擇 乙醇體積分數由1.2.3.1確定,提取時間為1.5 h,提取溫度為80 ℃,考察不同液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1 mL/g)對孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的影響。

1.2.3.3 提取時間的選擇 乙醇體積分數由1.2.3.1確定,液料比由1.2.3.2確定,提取溫度為80 ℃,考察不同提取時間(1、1.5、2、2.5、3 h)對孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的影響。

1.2.3.4 提取溫度的選擇 乙醇體積分數由1.2.3.1確定,液料比由1.2.3.2確定,提取時間由1.2.3.3確定,考察不同提取溫度(50、60、70、80、90 ℃)對孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的影響。

1.2.4 響應面實驗設計 在單因素實驗結果的基礎上,根據Box-Behnken設計原理,以酪氨酸酶抑制率為響應值,以乙醇體積分數、液料比、提取溫度、提取時間等因素為自變量,進行四因素三水平的響應面實驗,得到孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的最佳工藝條件。因素與水平設計見表1。

表1 響應面因素及水平設計Table 1 Factors and levels for response surface analysis

1.2.5 孜然乙醇提取物中主要活性成分的含量測定 多酚含量的測定采用Folin-Ciocalteu比色法[9],以沒食子酸為標準品。黃酮含量的測定采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法[10],以蘆丁為標準品。多糖含量的測定采用苯酚-硫酸比色法[11],以葡萄糖為標準品。皂苷含量的測定采用香草醛比色法[12],以薯蕷皂苷元為標準品。各活性成分的含量計算公式分別如下:

1.2.6 孜然乙醇提取物不同極性部位對酪氨酸酶活性的影響 按1.2.4得到的最佳提取條件獲得孜然乙醇提取物后,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取3次,旋轉蒸發除去溶劑,冷凍干燥后,按1.2.2的方法測定各極性部位對酪氨酸酶活性的抑制率,計算IC50(酪氨酸酶抑制率達到50%時的樣品濃度),曲酸做陽性對照。

1.3 統計分析

所有實驗均做三次重復,實驗結果以均值±標準差的形式表示,響應面設計及分析由Design-Expert 8.0.6.1完成,數據處理及繪圖由Origin 9.0完成。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 乙醇體積分數對孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的影響 由圖1可知,隨著乙醇體積分數的增大,孜然乙醇提取物對酪氨酸酶的抑制率呈先增大后減小的趨勢,乙醇體積分數為70%時,抑制率達最大,之后又開始下降。可能是乙醇體積分數過高時提取溶劑的極性小,使孜然中抑制酪氨酸酶活性的成分不易溶出所導致的[13],因此70%乙醇為最佳提取溶劑。

圖1 乙醇體積分數對孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on tyrosinase inhibition of ethanol extract from cumin

2.1.2 液料比對孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的影響 由圖2可知,隨著液料比的增大,孜然乙醇提取物對酪氨酸酶的抑制率呈增大趨勢,當液料比達到15∶1 (mL/g)時抑制率最大,之后基本保持不變。可能是隨著液料比的增大,會加快提取過程中液相和固相濃度差減小的速度,從而加快有效成分的溶出,從節約成本、提高效率的角度考慮,液料比不宜過大,故確定最佳液料比為15∶1 (mL/g)。

圖2 液料比對孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on tyrosinase inhibition of ethanol extract from cumin

2.1.3 提取時間對孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的影響 由圖3可知,隨著提取時間的延長,孜然乙醇提取物對酪氨酸酶的抑制率呈現先增大后減小的趨勢,當提取時間為2 h時，抑制率達最大,之后略有下降。可能是隨著提取時間的延長,孜然中抑制酪氨酸酶的成分逐漸溶到乙醇中,但提取時間過長,有些活性成分會在長時間的有氧及高溫條件下受到破壞,導致抑制率下降,所以最佳提取時間確定為2 h。

圖3 提取時間對孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的影響Fig.3 Effect of extraction time on tyrosinase inhibition of ethanol extract from cumin

2.1.4 提取溫度對孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的影響 由圖4可知,隨著溫度的升高,孜然乙醇提取物對酪氨酸酶的抑制率呈先增加后減小的趨勢,在80 ℃時抑制率達最大值,之后又有所下降。可能是在一定的溫度范圍內,隨著溫度升高,具有活性的物質溶解度會加大,但是超過一定溫度后,部分活性物質會被破壞[14],導致抑制能力減弱,故確定最佳提取溫度為80 ℃。

圖4 提取溫度對孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on tyrosinase inhibition of ethanol extract from cumin

2.2 響應面實驗結果與分析

2.2.1 響應面實驗設計方案及結果 根據Box-Behnken中心組合設計原理,結合單因素實驗結果,設計四因素三水平的響應面優化實驗,以獲得孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的最佳提取條件。響應面實驗設計及結果見表2。

表2 響應面實驗設計及結果Table 2 Design and test results of response surface

2.2.2 回歸方程擬合及方差分析 用Design-Expert 6.0軟件對表2數據進行二次多元回歸擬合,得到四個因素的二次多元回歸方程:

Y=42.75+0.49A+0.79B+1.10C+1.44D-0.59AB+0.31AC+1.18AD-0.71BC+0.25BD+0.74CD-2.50A2-1.66B2-2.38C2-3.16D2

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of varlance of the regression model

一次項中液料比、提取時間和提取溫度對酪氨酸酶抑制率的影響極顯著(p<0.01),乙醇體積分數對酪氨酸酶抑制率的影響顯著(p<0.05)。二次項中四因素對酪氨酸酶抑制率的影響均極顯著(p<0.01)。交互項中乙醇體積分數和提取溫度的交互作用對酪氨酸酶抑制率的影響極顯著(p<0.01),其他各因素兩兩之間的交互作用對酪氨酸酶抑制率的影響均不顯著(p>0.05)。

由F值可知,各個因素對酪氨酸酶抑制率的影響程度的次序為:D(提取溫度)>C(提取時間)>B(液料比)>A(乙醇體積分數)

2.2.3 響應面圖分析 利用 Design-Expert 8.0.6.1軟件作出各因素之間交互作用的響應面圖。等高線的形狀越接近橢圓,表示兩因素交互作用越顯著,接近圓形則與之相反。響應面曲面越陡,中心投影點越靠近橢圓中心,表示兩因素交互作用越顯著[15]。圖5所示為固定液料比和提取時間為零水平時,乙醇體積分數和提取溫度的交互作用對酪氨酸酶抑制率的影響極顯著。

圖5 乙醇體積分數和提取溫度的交互作用對酪氨酸酶抑制率的響應面圖Fig.5 The interactive effects of ethanol concentration and extraction temperature on tyrosinase inhibition rate

隨著乙醇體積分數和提取溫度的增加,酪氨酸酶抑制率也在不斷的增大,當增加到中心區域時,抑制率達到最大,隨著乙醇體積分數和提取溫度的繼續增加,提取率又隨之減小,且提取溫度的上升幅度大于乙醇體積分數的上升幅度,說明提取溫度對酪氨酸酶抑制率的影響較乙醇體積分數顯著。而其余各因素間的交互作用對酪氨酸酶抑制率的影響均不顯著,因此沒有在此提供交互作用影響不顯著的響應面圖。

2.3 驗證實驗

由Design-Expert 8.0.6.1軟件從回歸模型中得出最佳提取條件:乙醇體積分數71.41%,液料比15.68∶1 (mL/g),提取時間2.16 h,提取溫度為83.37 ℃,該條件下酪氨酸酶抑制率達到理論最大值43.20%。為驗證響應面實驗結果的可靠性并考慮到實際操作的可行性,將提取條件修正為:乙醇體積分數 71%,液料比16∶1 (mL/g),提取時間2.2 h,提取溫度為83 ℃。用修正后的條件進行三次平行驗證實驗,測得實際酪氨酸酶抑制率為(42.61%±0.56%),基本接近于預測值(43.20%)。說明該模型與實際情況擬合較好,證明了實驗的可靠性。

2.4 孜然乙醇提取物中主要活性成分的含量

分別以沒食子酸、蘆丁、薯蕷皂苷元、葡糖糖作為標準品,繪制標準曲線,得到關于標準溶液取樣量(mL)與吸光值的4個回歸方程:Y=0.3521X+0.0020,R2=0.9983;Y=0.2120X+0.0040,R2=0.9991;Y=0.4752X+0.0054,R2=0.9992;Y=0.1820X+0.0014,R2=0.9984。經計算,由表4可知,孜然乙醇提取物中黃酮和多糖的含量較高,皂苷含量較低。

表4 孜然乙醇提取物中主要成分的含量Table 4 The content of main components of cumin ethanol extract

已研究發現植物提取物中的多種活性成分,如酚類、黃酮類、有機酸、多糖類等具有美白潛力,其中多酚類和黃酮類物質具有較大的美白潛力,因為它們與酪氨酸酶的底物(酪氨酸或多巴)有著相似的結構,可以作為底物類似物結合酪氨酸酶,從而減弱底物與酪氨酸酶的結合能力,達到減少黑色素生成的目的[16-17]。

2.5 孜然乙醇提取物不同極性部位對酪氨酸酶活性的影響

由表5和表6可知,孜然乙醇提取物不同極性部位對酪氨酸酶活性的抑制能力均比曲酸(陽性對照)弱,但也有較好的抑制作用。可能是孜然乙醇提取物相對來說是粗提取,其中含有一些雜質或具有拮抗作用的成分,從而造成孜然乙醇提取物不同極性部位對酪氨酸酶活性的抑制效果不是很突出[18]。各相對酪氨酸酶活性的抑制率隨著濃度的增大而增大,IC50從大到小依次為:水相、石油醚相、正丁醇相和乙酸乙酯相,表明乙酸乙酯相和正丁醇相對酪氨酸酶活性的抑制能力最好,可能是孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的成分主要集中在中等極性和極性較大的部位。多酚、黃酮、皂苷、多糖等都為極性較大的物質,因此它們都可能是孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的功效成分。

表5 不同極性部位對酪氨酸酶活性的影響Table 5 Effects of different polar fractions on tyrosinase activity

表6 曲酸對酪氨酸酶活性的影響Table 6 Effect of kojic acid on tyrosinase activity

3 結論

在單因素實驗結果的基礎上結合響應面設計,優化得到了孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的最佳工藝參數:乙醇體積分數71%,液料比16∶1 (mL/g),提取時間2.2 h,提取溫度83 ℃,在此優化條件下酪氨酸酶抑制率達(42.61%±0.56%),與預測值43.20%接近。表明由響應面法得到的孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶的提取工藝是有效可行的;孜然乙醇提取物中多酚、黃酮、皂苷、多糖四種活性成分的含量分別為(1.35%±0.03%)、(4.40%±0.29%)、(0.76%±0.04%)、(4.89%±0.28%);孜然乙醇提取物不同極性部位對酪氨酸酶活性均有抑制作用,且與濃度有依賴關系,其IC50從大到小依次為:水相>石油醚相>正丁醇相>乙酸乙酯相,表明乙酸乙酯和正丁醇部位富集了孜然乙醇提取物抑制酪氨酸酶活性的主要活性成分,其抑制機理有待進一步研究,為深入研究孜然的美白功效提供依據。

[1]Chen M J,Hung C C,Chen Y R,et al. Novel synthetic kojic acid-methimazole derivatives inhibit mushroom tyrosinase and melanogenesis[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering,2016,122(6):666-672.

[2]Ding H Y,Chou T H,Lin R J,et al. Antioxidant and antimelanogenic behaviors ofPaeoniasuffruticosa[J]. Plant Foods for Human Nutrition,2011,66(3):275.

[3]樓彩霞,田燕澤,樸香蘭. 連翹不同極性部位對酪氨酸酶活性抑制作用研究[J]. 時珍國醫國藥,2011,22(10):2415-2416.

[4]Siow H L,Gan C Y. Functional protein from cumin seed(Cuminumcyminum):Optimization and characterization studies[J]. Food Hydrocolloids,2014,41(20):178-187.

[5]馬夢梅. 孜然膳食纖維改性及降血糖活性研究[D]. 北京:中國農業科學院,2016.

[6]王卓. 維藥孜然不同提取物抗氧化及對α-葡萄糖苷酶抑制的研究[D]. 烏魯木齊:新疆大學,2016.

[7]羅靜鶯,索菲婭,盧帥,等. 孜然果實發育過程中抗氧化活性的研究[J]. 時珍國醫國藥,2015(10):2505-2507.

[8]Wang G H,Chen C Y,Lin C P,et al. Tyrosinase inhibitory and antioxidant activities of threeBifidobacteriumbifidum-fermented herb extracts[J]. Industrial Crops and Products,2016,89:376-382.

[9]Dewanto V,Wu X,Adom K K,et al. Thermal processing enhances the nutritional value of tomatoes by increasing total antioxidant activity[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2002,50(10):3010-3014.

[10]王雅. 沙棗果實可食部分活性物質提取及抗氧化、抗腫瘤作用研究[D]. 楊凌:西北農林科技大學,2012.

[11]孔凡利,張名位,于淑娟,等. 荔枝多糖活性炭脫色方法研究[J]. 食品科技,2008,33(6):115-117.

[12]傅春燕,劉永輝,李明娟,等. 紫外可見分光光度法測定不同產地龍牙百合中皂苷含量[J]. 廣東微量元素科學,2011,18(5):55-58.

[13]董妙音,李萬武,孔維寶,等. 響應面法優化超聲波輔助提取文冠果種皮總皂苷的工藝[J]. 中國油脂,2014,39(11):74-78.

[14]吳祥庭,朱濤,鄭巧敏,等. 響應面法優化山藥皮中皂苷提取的研究[J]. 中國糧油學報,2011,26(6):91-96.

[15]蒲立檸,陳光靜,闞建全. 響應面實驗優化青稞麩皮薏仁紅曲霉發酵工藝[J]. 食品科學,2017,38(2):264-270.

[16]龔堅,劉朝圣. 美白中藥實驗研究進展[J]. 中醫藥導報,2015(16):100-103.

[17]Roh H J,Noh H J,Na C S,et al. Phenolic compounds from the leaves ofStewartiapseudocamelliamaxim and their whitening activities[J]. Biomolecules and Therapeutics,2015,23(3):283-289.

[18]王姝. 鵝毛竹葉提取物抗氧化及酪氨酸酶抑制活性的研究[D]. 杭州:浙江農林大學,2014.