低溫淀粉酶菌種分離純化與發酵生產研究

張勃，趙春海，霍寧波

（1.乳山市漁政監督管理站，山東威海264500；2.濱州職業學院，山東濱州256603）

隨著世界環境污染的日益嚴重和能源危機的不斷加劇，節能環保的科技項目日益受到重視，結合我國在全國范圍內推行新舊動能轉換，提升企業發展的科技水平。根據目前淀粉的應用領域和范圍分析，低溫淀粉酶可以在生產中替代中溫和高溫淀粉酶的應用領域，同時降低反應條件，避免了在酶解中對生產原料和其中不耐高溫物質的破壞同時低溫淀粉酶的工作環境也在一定程度上降低了對溫度即能源的需求，使得低溫淀粉酶在大規模生產領域優勢明顯，同時低溫淀粉酶的活性條件容易實現，在環境處理中是一種高效生物治理方法[1]。

淀粉酶在以糖為原料的工業生產中應用非常廣泛，可應用于多種酒類及酒精發酵，發酵食品中的催熟劑和動物飼養等行業。同時糖化酶在輕工、食品、醫藥、發酵等行業中具有廣泛的應用價值，受到國內外學者的高度重視。隨著研究的深入對其酶學結構、作用機理、結構功能相關性等問題有了一定的了解，其應用領域和范圍更加廣泛[3-4]。

基于黃河三角洲區域特點，蘊育著獨特的微生物資源，為了充分開發和利用本地區的微生物資源，發酵生產低溫淀粉酶，有利于拓寬低溫淀粉酶的生產來源，豐富低溫淀粉酶家族成員，有利于對低溫淀粉酶酶學性質的研究，不論是應用還是理論研究都具有重要意義。

1 材料與設備

1.1 采樣及菌種

樣品：濱州本地區土樣、水樣。

1.2 試劑

1）0.1 mol/L醋酸緩沖溶液（pH5.0～6.0）。

2）Somogyi氏試劑（酒石酸鉀鈉、Na2CO3、NaHCO3、CuSO4、鉬酸銨、砷酸氫二鈉）國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 主要儀器設備

GTR16-2高速低溫離心機：北京時代北利離心機有限公司；FA1004B電子分析天平：上海平軒科學儀器有限公司；CX21BIM-SET5顯微鏡：上海譜騫光學儀器有限公司；T6紫外分光光度計：上海添時科學儀器有限公司；ABI-2720PCR 儀：Applied Biosystems，美國。

1.4 培養基

平板篩選培養基：可溶性淀粉2%，蛋白胨2%，酵母膏1%，瓊脂2%，pH自然，115℃滅菌，30 min。

發酵培養基：葡萄糖1%，可溶性淀粉1%，蛋白胨2%，酵母粉1%，瓊脂2%，pH自然，115℃滅菌30 min。

1.5 菌種的分離與篩選

1.5.1 菌株的初篩

樣品→選擇性培養基平板分離→最適生長溫度測定→搖瓶篩選→菌株獲得→酶活測定[2]

1.5.2 菌株的復篩

初篩的純菌種培養于250 mL三角瓶中，發酵培養基72 h，進行酶活測定。

1.5.3 粗酶分離及酶活測定

淀粉酶活力測定是通過測定還原糖的增加進行測定。將經過震蕩培養48 h后的發酵液離心，收集上清液測定酶活。將用醋酸緩沖溶液（pH5.0）制備的淀粉溶液作為底物。按照粗酶液與底物體積比1∶10比例混勻，50℃水解30 min后沸水浴中5 min終止反應。以Nelson—Somogyi方法測定還原糖濃度。酶解產生1.0 μmol葡萄糖所需的酶量定義為1個酶活性單位（U/mL）[5]。

1.5.4 最適溫度的選擇

將分離的菌種接種在篩選平板上，將平板放置于不同溫度條件下培養，3 d～4 d后觀察，并在生長較為理想的平板上滴加碘液，根據顯色挑出菌落在35℃繼續培養，根據水解圈直徑和菌落直徑比值，確定發酵復篩的菌株。

1.5.5 菌種的鑒定[5]

1.5.5.1 形態觀察

通過菌落形態、細胞形態進行初步鑒定。

將平板分離的單個菌落通過電子顯微鏡下觀察細胞形狀、大小、繁殖方式。

1.5.5.2 糖發酵測試

選擇葡萄糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖、蜜二糖、蔗糖和棉子糖進行試驗。將質量體積百分含量為10.0%的糖溶液10 mL裝在管中滅菌后使用，用注射器去定量的糖液分裝于杜氏管，接種于試管中25℃～28℃下培養觀察。菌種發酵糖后產氣就會在杜氏小管頂端出現空管現象，既可以判定為陽性（+），反之為（-）。

1.5.5.3 碳源同化

測試碳源選擇葡萄糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖、蜜二糖、蔗糖、棉子糖、纖維二糖、海藻糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、山梨糖和可溶性淀粉等。將菌種分別接種在含有0.5%唯一同化碳源的基礎培養液中，25℃～28℃下培養，以葡萄糖和不加任何碳源的空白分別作對照，凡是能生長的判定為陽性（+），反之為陰性（-）[5]。

1.5.5.4 分子生物學鑒定

通過分離菌株的基因組中ITS測序結果，在GenBank數據庫中進行同源比對與分析，并進行進化樹繪制。

1.5.6 發酵條件的優化

進行菌種生長規律的測定，單因子發酵條件試驗，并進行菌種產酶時間的探索研究。

2 結果

2.1 菌種的分離結果

2.1.1 平板菌落與淀粉水解

將初篩菌株分別接種在含有淀粉的平板上，28℃培養觀察淀粉水解情況，結果如圖1～圖2所示。

圖1 菌株Bz-11與Bz-25菌落與水解圈Fig.1 The colony and hydrolytic circle of Bz-11and Bz-25

圖2 Bz-38與Bz-73菌落與水解圈Fig.2 The colony and hydrolytic circle of Bz-38 and Bz-73

圖1、圖2中分離的不同菌株在固體平板上都出現了水解圈，證明這些菌株可以生產胞外淀粉酶，但是菌株是否同時可以合成胞內淀粉酶、而且這些胞外酶是否為低溫淀粉酶還需要進一步驗證[7-8]。

部分初篩菌株在不同生長溫度的透明圈與菌落直徑比值見表1。

表1 不同菌株在不同溫度下水解圈與菌落直徑比值Table1 The ratio of hydrolytic circle to colony diameter from different strains at different temperatures

由表1 可知，Bz38 酶活最高，Bz11、Bz25、Bz38、Bz73相似；這些菌最適生長溫度均在20℃左右，較常規報道使用的產酶微生物的培養溫度低，與文獻報道的產低溫淀粉酶的低溫微生物生長溫度一致[9]。

2.1.2 發酵復篩結果

經過初篩得到 Bz11、Bz25、Bz38、Bz73，根據水解圈與菌落直徑比值，選擇了其中Bz11、Bz38兩株相對較高菌株在20℃搖瓶液體發酵48 h，取發酵液離心后收集上清液即為粗酶液，進行酶活測定，結果如表2所示。

表2 2菌株發酵復篩結果Table 2 Rescreening results of strain fermentation

搖瓶液體發酵酶活分別為590 U/mL和660 U/mL，從平板固體培養與搖瓶液體發酵試驗都證明了Bz38菌株產酶活性較高，因此選擇野生型菌株Bz38作為產酶試驗對象，進行鑒定與發酵研究。

為了驗證淀粉酶的水解作用，分別以單糖、二糖、三糖為對照，以淀粉水解液為待測樣品，進行層析色譜分析，結果如圖3所示。

圖3 葡萄糖淀粉酶酶解淀粉層析圖Fig.3 The chromatography from glucoamylase hydrolyzed starch

由圖3可知，淀粉酶水解層析試驗，通過層析結果表明，分離菌株產生的淀粉酶可以將淀粉水解成不同大小分子[10-11]。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 生理和生化鑒定

將分離菌株劃線于平板上，進行菌落觀察如圖4（A）所示，菌落表明光滑、整齊、濕潤成乳白色；將分離菌株細胞在顯微鏡下觀察圖4（B）所示，部分細胞呈現大小兩個連在一起的現象，典型酵母菌出芽生殖特征。

圖4 Bz38菌落形態與細胞形態Fig.4 Bz38 colony morphology and cell morphology

酵母菌生理生化特性鑒定指標有碳源發酵測試、碳源同化、本試驗篩選葡萄糖、麥芽糖等7種糖進行發酵試驗（表3），選擇葡萄糖、麥芽糖等12種糖進行碳源同化試驗，結果見表3和表4。

表3 酵母菌BZ38的糖發酵試驗結果Table 3 The results of BZ38 sugar fermentation test

表4 產酶菌株BZ38碳源同化試驗Table 4 Carbon source assimilation test of strain Z38

酵母菌BZ38不能發酵利用常見糖類（表3），但是可以通過同化方式利用葡萄糖糖、麥芽糖、蔗糖（表4）等，與常見酵母菌碳源發酵、碳源同化結果一致。

2.2.2 分子生物學鑒定試驗結果

為了進一步掌握確定菌株的分離地位，提取酵母BZ38菌株的基因組DNA，如圖5所示，平行提取5組進行電泳檢測，并通過酵母通用引物測定了其26S rDNA序列結果如圖6所示，擴增片段大小為500 bp左右。將這個序列與GenBank數據庫中其它酵母菌的26S rDNA序列進行比[5]。

圖5 BZ38基因組DNA（1kb maker）Fig.5 The genome DNA of BZ38（1kb maker）

圖6 26SrDNA PCR擴增結果（D2000maker）Fig.6 PCR amplification results from 26SrDNA（D2000maker）

為了進一步確定分離獲得的菌株B38在微生物中的分類地位，在NCBI數據庫和CBS菌種庫中尋找出各個物種菌株的rDNA序列，與菌株的ITS序列經比對后，用MEGA6.0軟件通過Neughbor-Joining法構建進化樹，見圖7。

圖7 菌株BZ38 26S rDNA序列進化樹結果Fig.7 Sequence evolution tree results of strain BZ38 26S rDNA

通過與已知鑒定的酵母菌標準菌株菌落和細胞形態相比，菌株BZ38解脂耶羅威亞酵母（Yarrowia lipolytica）接近，通過ITS序列進行比對與進化樹的結果進一步驗證了形態與生理生化方法對株菌的鑒定，BZ38與解脂亞羅酵母（Yarrowia lipolytica）親緣關系最為相近，下一步研究以BZ38為研究對象[12-13]。

2.3 發酵條件試驗

2.3.1 生長曲線的測定

生產曲線是單細胞微生物特有的生長規律，為了準確掌握BZ38生長階段規律變化，進行了生長曲線的測定，結果如圖8所示。

圖8 Bz38菌株成長曲線Fig.8 Growth curve of Bz38 strain

對菌種Bz38在YPD培養基上進行了生長曲線的測定，從圖8可以看出生長規律基本符合單細胞微生物群體生長規律，生長曲線表明菌體12 h左右進入穩定期，為進一步發酵條件的優化奠定了基礎。

2.3.2 單因子試驗

2.3.2.1 碳源對產酶發酵的影響

在只改變原培養基碳源的情況下，以葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇5種糖做單一碳源時，濃度分別選10、15、20 g/L 3個濃度，考查不同碳源對產酶活性的影響，結果見表5。

表5 不同碳源條件對比酶活的影響Table 5 Effects of different carbon source conditions on enzyme activity

由表5可知，以酶OD值為主要指標，試驗數據顯示蔗糖酶為碳源時酶活性較大，其次是葡萄糖，麥芽糖、乳糖、甘露醇3種物質為碳源產酶時，酶濃度較低。結果也表明碳源對Bz38 Yarrowia lipolytica發酵的淀粉酶有很大影響[14]。

不同碳源種類試驗中也表明同一種碳源不同濃度也會對酶活產生影響，選擇了對酶活影響比較大的蔗糖和葡萄糖進行試驗見圖9。

圖9 兩種碳源不同濃度對產酶的影響Fig.9 Effects of different concentrations of two carbon sources on enzyme production

由圖9所示，在一定濃度范圍內隨著碳源濃度增加，酶活力也隨之提高，到了30 g/L，酶活性開始降低，可能是高濃度的糖，增加了發酵液的濃稠度，影響了菌體對氧氣的利用，進而影響酶的合成和活性，補料發酵可以避免上述情況的發生。蔗糖對應的酶活比葡萄糖的高，成本又低，應選擇蔗糖。考慮到20 g/L與25 g/L的酶活差不多，為了節省成本，所以選擇20 g/L蔗糖。

2.3.2.2 氮源對產酶發酵的影響

有機氮源來源充足，但是微生物生長和很多大分子物質合成所必需，又是在酶代謝合成中，雖然有機氮源被微生物利用緩慢，但對培養基組成意義重大。

通過搖瓶試驗已初步確定出碳源，所以把此試驗結果用于優化氮源的試驗中，即碳源改為25 g/L蔗糖。在選擇有機氮源的試驗中，分別選用了牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、尿素、酪蛋白胨、硫酸銨6種有機氮源。試驗結果見表6。

表6 不同氮源對酶活的影響Table 6 Effects of different nitrogen sources on enzyme activity

從表6可以看出，選擇酵母膏、牛肉膏作為氮源時酶活相對較高，其它幾種有機氮源的酶活較低，確定酵母膏為有機氮源，同時考慮到微生物對氮源的利用分為遲效率氮源，和速效氮源，進一步增加硫酸銨作為下一步有機氮源配合使用的備選氮源。

3 結論

通過對黃河三角洲地區的土樣中微生物的采集、分離獲得了4株產葡萄糖淀粉較高的菌株：Bz11、Bz25、Bz38、Bz73，經過復篩最終選擇產酶相對較高的Bz38作為研究對象進行研究，通過平板菌落觀察、顯微鏡細胞觀察，碳源發酵與同化試驗、26srDNA分子生物學鑒定，最終確定為Bz38為解脂亞羅酵母菌。通過生長曲線測定掌握菌株生長規律的基礎上，進行單因子碳源、氮源試驗酶活達到960 U/mL，為全面應用葡萄糖淀粉酶奠定了堅實的力量基礎，也極大的豐富了本地區對微生物種植資源的開發和利用。

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