NH3應激肉雞呼吸道兩株致病菌的分離和鑒定

（商丘師范學院生物與食品學院，河南商丘476000）

隨著消費者膳食結構的改變和安全意識的增強，動物源性食品安全已經成為全球共同關注的熱點問題。近年來，我國肉雞養殖業發展態勢迅猛，已然成為世界第二大肉雞生產國[1]，畜舍空氣質量是保證肉雞養殖成功和保障雞肉品質的關鍵[2]。然而，由于高密度、集約化的養殖模式，養殖環境特別是雞舍內有害氣體對肉雞生產所帶來的危害亦愈發嚴重，其中，NH3被認為是肉雞舍內最有害的氣體[3-5]，直接刺激、損傷畜禽呼吸道，形成呼吸道炎癥，誘發呼吸系統疾病，并引起其他并發癥。而且，據研究報道，長時間低濃度的NH3刺激，會有助于病原微生物在動物機體內的定植[6]，損傷肉雞呼吸道上皮細胞，造成呼吸困難，降低免疫力，引發結膜炎和腹水癥，大大提高肉雞的死亡率和發病率，給肉雞養殖業帶來巨大的經濟損失[3，7-8]。并且雞舍高濃度氨氣可降低雞的抗氧化能力，影響雞肉品質，且隨著氨氣濃度的升高而逐漸增強，具有時間累加效應[9]。

研究證明，養殖場的NH3通過刺激嗅覺神經和三叉神經，易引發慢性支氣管炎、高早產死亡率、哮喘疾病等，影響人畜的呼吸功能，危害人畜健康[10-11]，也是養殖場周邊環境空氣質量PM2.5形成的主要原因之一[9，12]。呼吸道是一個開放性器官，是NH3進入動物機體的門戶，而呼吸道正常菌群是抵御外來異物的第一道防線，對于動物機體的免疫功能起著至關重要的作用。但是，迄今為止，對于NH3應激條件下，由呼吸道微生態失衡而造成的雞源肉制品安全的相關研究還鮮見報道。

因此，本研究將于NH3應激肉雞呼吸道中采集喉拭子，對呼吸道微生物進行分離純化，探索畜舍空氣環境質量對肉雞呼吸道微生態的影響，揭示NH3應激條件下雞源肉食品的潛在安全風險及其實質。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

將1日齡健康羅斯308肉雞公雛和母雛各10羽，置于密閉的環境控制倉，內置監控攝像頭可隨時觀察實驗動物的行為變化，并安裝固定式氨氣氣體檢測儀FIX800-NH3-A（深圳市萬安迪科技有限公司）以實時監測舍內氨氣濃度，舍內氨氣濃度為60 mg/m3。試驗為期42 d，自由采食。

1.1.2 培養基

營養瓊脂培養基、胰酪大豆胨液體培養基、MH肉湯培養基：青島海博生物技術有限公司。

1.1.3 試劑與儀器

λDNA/HindⅢ：生工生物工程（上海）股份有限公司；2000 DNAMarker：寶生物工程（大連）有限公司；2×Taq MasterMix：上海萊楓科技有限公司；脫脂奶粉：內蒙古伊利實業集團股份有限公司；檸檬酸鈉、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）：天津市縱橫工貿有限公司化工試劑公司；無水乙醇（分析純）：天津基準化學試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、氯化鈉（NaCl，分析純）：天津市德恩化學試劑有限公司；三氯甲烷（trichloromethame，分析純）；異戊醇（分析純）：天津大茂化學試劑廠；三（羥甲基）氨基甲烷 [tris-（hydroymethyl）-aminomethane，分析純]：天津市科密歐化學試劑有限公司。

Telstar BIO IIA超凈工作臺：西班牙Telstar；Centrifuge 5424小型高速離心機、Centrifuge 5810R臺式高速冷凍離心機：德國Eppendorf；JY-SPCT凝膠電泳槽、JY600+雙恒定時電泳儀：北京君意東方電泳設備有限公司；MLS-3750立式高壓滅菌器、MDF-4186S超低溫冰箱：日本SANYO；Gel Doc XR+凝膠成像儀：美國Bio-Rad；Piko Real實時熒光定量PCR儀：美國Thermo Fisher Scientific；Direct-Q3超純水一體化系統：美國Millipore；DNP-9082電熱恒溫培養箱、ZHP-100智能恒溫震蕩培養箱：上海三發科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集與處理

用無菌棉拭子于咽后壁取樣，于無菌操作臺上將取樣后的棉拭子放入裝有5 mL無菌生理鹽水的10 mL離心管中，折斷手柄；震蕩離心管，用移液器吸取100 μL液體涂布胰酪大豆胨液體培養基平板；將接過菌的平板置于恒溫培養箱中，37℃培養24 h。

1.2.2 菌株分離與純化

利用平板劃線接種法進行微生物分離。挑取平板上不同形態的菌落并在營養瓊脂培養基五點劃線后，將平板置于恒溫培養箱中，37℃培養24 h。重復上述操作直至平板上長出單個菌落。挑取平板上單菌落于裝有MH肉湯培養基的試管內，分別標記TSB87001、TSB87002和TSB87003。

液體培養24 h后，用凍存管和離心管從每管菌液中各取約1.5 mL，1 000 g高速離心5 min，于超凈工作臺上倒掉上清，凍存管內加入約1.5 mL的脫脂牛奶充分混勻后，放入-80℃冰箱內進行菌種保存。離心管內的菌體凍存在-20℃，以備提取DNA。

1.3 微生物的分子鑒定

1.3.1 微生物DNA的提取

取出凍存在-20℃的菌體，向離心管內加入500 μL 0.15 mol/L NaCl-檸檬酸鈉緩沖液重懸菌體，移至無菌研磨器中，仔細研磨10 min；1 mL NaCl-檸檬酸鈉緩沖液沖洗研磨杵上的菌體2次至研磨器中，將研磨器中的液體移至離心管中，用NaCl-檸檬酸鈉緩沖液沖洗研磨器2次每次1 mL，沖洗液移至離心管內，6 000 r/min，4℃離心10 min，棄上清；向沉淀中加入5 mL NaCl-檸檬酸鈉緩沖液，重懸沉淀；6 000 r/min，4℃離心10 min，棄上清；再用5 mL NaCl-檸檬酸鈉緩沖液重懸沉淀，6 000 r/min，4℃離心10 min，棄上清；用5 mL 0.15 mol/L NaCl-EDTA和1 mL 0.05 g/mL SDS重懸沉淀，并振蕩10 min；取4.5 mL至另一離心管中，加 4.5 mL 氯仿異戊醇（24∶1）振蕩 10 min，3 600 r/min，4℃離心10 min；取最上層水相加入等體積氯仿異戊醇，3 600 r/min，4℃離心10 min；取上清加入95%乙醇邊加邊搖動至DNA析出或放入冰箱冷凍10 min～30 min，12 000 r/min，4℃離心 10 min；用 75%乙醇洗滌2次，置超凈工作臺中晾干；用50 μL 1×TE緩沖液或ddH2O溶解沉淀，并轉移至1.5 mL離心管中，分裝4 μL用于電泳檢測，置-20℃冰箱保存備用。

1.3.2 引物的選擇及PCR反應

采用細菌 16S rRNA 基因通用引物：（27F）5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和（533R）5’-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’進行PCR擴增。引物由華大基因科技股份有限公司（北京）合成。

PCR 總體系為 25 μL，其中 12.5 μL 2× Taq Master Mix，基因組DNA為1 μL，正向和反向引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL。于 94℃預變性 5 min，94℃變性 30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環，最后72℃延伸10 min。

1.3.3 PCR產物的凝膠電泳監測

擴增產物采用1.5%的凝膠電泳檢測，電泳緩沖液1×TAE[三（羥甲基）氨基甲烷乙酸鹽乙二胺四乙酸緩沖液，tris acetate-EDTA buffer]，1 μL 上樣緩沖液與2 μL基因組DNA混合均勻點樣，同時點5 μL DL2 000 Marker作為參照，100 V電壓下電泳20 min，溴化乙錠染色，在凝膠成像系統下觀察結果并照相。

1.3.4 菌種鑒定

將含有目的條帶的PCR產物送華大基因科技股份有限公司（北京）測序。序列利用http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi進行比對，確定微生物種屬。如果兩條序列的相似性小于97%，就認為是不同的序列類型[13-17]。

2 結果與分析

2.1 PCR產物的電泳結果分析

將分離得到的3株菌提取基因組DNA后，用細菌16S rRNA基因通用引物27F/533R進行PCR擴增，擴增產物電泳結果如圖1所示，在約500 bp處，樣品TSB87001、TSB87002有目的條帶而樣品TSB87003沒有目的條帶，說明此樣品DNA中沒有所要的細菌DNA，因此，此樣品不再做進一步研究。

2.2 菌種的分子鑒定

圖1 分離菌株的16S rRNA基因的PCR電泳結果Fig.1 The PCR electrophoresis results of the 16S rRNA gene of the isolated strains

選擇含有目的條帶的樣品TSB87001、TSB87002的PCR產物送去測序。測序結果進行Blastn序列比對，結果表明：菌株TSB87001和TSB87002分別與Cronobacter sakazakii（GenBank：HQ880345.1）和Vibrio cholerae（GenBank：JN873349.1）的相似性達到 97%，初步鑒定為阪崎腸桿菌和霍亂弧菌。

3 討論

畜舍空氣質量是保證畜禽養殖成功和畜產品質量安全的重要保證[2]。NH3是畜舍內產生量最多、危害最大的有害氣體之一[18-19]，通過鼻腔進入呼吸道，破壞心臟和氣管組織，造成繼發感染和破壞肌肉細胞膜的完整性，造成肉品質下降[21-22]，同時給養殖工人和周邊環境帶來嚴重威脅。長期生活于NH3環境中的畜禽對病原微生物的易感性增加，可引起呼吸道損傷[19]，誘發呼吸系統疾病及其他并發癥，給養殖場帶來巨大的經濟損失。但是，由畜舍空氣環境質量造成雞肉食品安全的具體研究還鮮見報道。

本研究將羅斯308肉雞飼養于一定濃度的NH3環境中，經過稀釋平板法和借助分子生物學技術，從NH3應激肉雞呼吸道中分離到了兩株致病菌阪崎腸桿菌和霍亂弧菌，研究結果為畜舍空氣質量直接影響畜產品品質及安全提供了直接的試驗證據。阪崎腸桿菌是一種有周生鞭毛、能運動、兼性厭氧的、人和動物腸道內寄生的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，在一定條件下可引起人和動物致病[22-25]，該菌雖然從不同環境和食物樣品中都曾被檢測到，如奶粉、水、面包、香腸、蔬菜等[23]，但其在自然界的傳播渠道和污染來源尚不清楚。阪崎腸桿菌正是由于能夠形成菌毛結構，除可幫助細菌浸染外，還使得阪崎腸桿菌非常容易黏附在各種表面。霍亂弧菌是引起雞霍亂的致病菌，引發雞出血性敗血癥，是嚴重危害養雞業的一種急性敗血性傳染病，該病的死亡率很高，最急性病例幾乎看不到前驅癥狀而突然死亡。

畜舍空氣環境質量不佳，特別是NH3濃度過高，除了會影響肉雞生長性能和存活率之外，還會損傷氣管的免疫功能[19]，如雞舍中的NH3濃度達到50 mg/L時，引起呼吸道粘膜充血、水腫，發生支氣管炎、肺炎等[10]。而且，雞舍內的NH3會影響肉雞的免疫功能，降低特異性抗體滴度和提高疾病易感性[8]，給肉雞養殖業帶來經濟損失。但是，就目前為止，由畜舍空氣質量直接影響畜產品品質及其質量安全的研究還很少見到報道，而本研究的結果為此直接提供了試驗證據。并且，進一步驗證了前人研究成果，即畜禽在NH3應激條件下，病原微生物容易侵入動物機體，增加了動物源性食品安全問題的風險。因此，本研究結果將加強畜牧工作者改善畜舍空氣質量以保障肉雞的生態養殖和健康可持續發展的決心，及為人民提供安全、綠色的動物源性肉制品奠定物質基礎。

4 結論

在動物的生命和提供畜產品的生產活動中，除了遺傳、營養、疫病防治外，環境因素也是重要的一環。環境因素會直接或間接影響畜禽養殖業，本研究從微生態角度入手，研究畜舍內空氣環境質量對肉雞呼吸道微生物的影響，研究結果證明了在高濃度NH3環境中，病原微生物會更容易定制于肉雞機體內，從而揭示了畜舍空氣質量引發雞源肉食品的潛在安全風險及其機制。

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