高效液相色譜法同時測定方便面中16種多環(huán)芳烴

高慧，汪洋，王敏，王勤

（淄博市疾病預(yù)防控制中心，山東淄博255026）

多環(huán)芳烴是（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）指兩個或兩個以上苯環(huán)[1]以稠環(huán)形式相連的化合物有4個或少于4個苯環(huán)的屬于輕質(zhì)多環(huán)芳烴，多于4個苯環(huán)的屬于重質(zhì)多環(huán)芳烴[2]。在目前環(huán)境中存在廣泛，食物在高溫時會分解出大量的多環(huán)芳烴，多環(huán)芳烴可通過皮膚、呼吸道和被污染的食物進入人體，在體內(nèi)代謝活化為多環(huán)芳烴環(huán)氧化物，與DNA、RNA和蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合而誘發(fā)突變和腫瘤[3]，其暴露的最大毒性為致癌性[4]。植物油中多環(huán)芳烴的檢測方法有色譜-質(zhì)譜法[5]、高效液相色譜法[6-8]、超高效液相色譜法[9-10]。目前方便面中多環(huán)芳烴的檢測方法，報道較少。由于方便面樣品基質(zhì)復(fù)雜，因此建立一種靈敏，高效的檢測方法是發(fā)展的必然趨勢。本研究通過對色譜條件、樣品前處理條件等的優(yōu)化，建立了一種快速、準(zhǔn)確測定方便面中16種多環(huán)芳烴的高效液相色譜方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters e2695高效液相色譜儀（帶熒光檢測器和二極管陣列檢測器）：美國沃特世公司；12位固相萃取儀：美國色譜科公司；N-EVAP 112氮吹濃縮儀：美國OA-SYS；CP-225D電子天平：德國賽多利斯；ST-16R高速離心機：美國賽默飛世爾科技有限公司；KS-500D型超聲波清洗器：寧波科生儀器廠。

Milli-Q超純水系統(tǒng)：美國密理博公司；Oasis HLB固相萃取柱（6mL/200 mg）、Sep-Park Florsil固相萃取柱（6 mL/1 g）：美國沃特世公司；石油醚、乙腈、丙酮、二氯甲烷、甲醇、正己烷、甲苯（均為HPLC級）：德國默克公司；16種PAHs標(biāo)準(zhǔn)溶液（200 μg/mL，甲醇溶劑），編號：Z-013-17：美國AccuStandard公司。精確取16種PAHs有證標(biāo)準(zhǔn)溶液（200 μg/mL）50 μL，加 2 mL 甲苯，用乙腈定容至10 mL，制得標(biāo)準(zhǔn)溶液中間液（1 000 ng/mL）。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱（WatersPAHC18analytical column，4.6mm×250 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；進樣體積：10 μL；流動相：水+乙腈；流速：1.0 mL/min。流動相梯度見表1。

表1 流動相梯度表Table 1 Mobile phase gradient table

苊烯在熒光沒有響應(yīng)，所以用二極管陣列檢測器檢測，其他15種PAHs用熒光檢測器檢測。兩個檢測器流動相梯度相同，檢測波長苊烯：230 nm，其他15種PAHs的檢測激發(fā)波長和發(fā)射波長見表2。

表2 15種PAHs的檢測激發(fā)波長和發(fā)射波長Table 2 Detection excitation wavelength and emission wavelength of 15 PAHs

續(xù)表2 15種PAHs的檢測激發(fā)波長和發(fā)射波長Continue table 2 Detection excitation wavelength and emission wavelength of 15 PAHs

1.2.2 樣品前處理

稱取方便面樣品20.0 g，以石油醚進行油脂提取，提取液加熱揮發(fā)除去石油醚，制備得到油脂，稱重，備用。稱取2.0 g油脂于15 mL塑料離心管中，加入5 mL乙腈：丙酮（1∶1，體積比）混合提取液，渦旋 30 s，超聲5 min，8 000 r/min下離心5 min。小心提取上層液體于另一10 mL離心管中，重復(fù)加提取液提取兩次，合并提取液，35℃水浴下氮吹至3.0 mL左右，等待過柱凈化。

第一次凈化：采用Waters Oasis HLB柱進行凈化，依次10 mL二氯甲烷、10 mL甲醇、10 mL乙腈對柱子進行活化；將上述提取液過柱，同時用玻璃離心管進行收集；再用5 mL乙腈 ∶丙酮（1∶1，體積比）進行清洗，5 mL二氯甲烷進行洗脫兩次，洗脫液均收集于玻璃離心管中，收集的洗脫液于35℃水浴下氮吹至0.2 mL左右，加入正己烷定容至2.0 mL（等待后續(xù)第二次凈化用）。

第二次凈化：采用Sep-Pak Florsil柱進行凈化，依次15 mL二氯甲烷、15 mL正己烷對柱子進行活化；將第一次凈化后收集液過柱，同時用玻璃離心管進行收集；再分別用5 mL正己烷清洗，5 mL正己烷∶二氯甲烷（2∶1，體積比）洗脫兩次，洗脫液收集于同一玻璃離心管。

濃縮：將第二次凈化后的洗脫液在35℃下氮吹濃縮至近干，加入甲苯0.2 mL，加入乙腈定容至1.0 mL，過0.22 μm的有機過濾膜后供HPLC上機測定。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用1.1標(biāo)準(zhǔn)溶液中間液（1 000 ng/mL）稀釋出1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 ng/mL 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，分別進樣10 μL，記錄色譜圖，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度和峰面積進行回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以保留時間定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇和優(yōu)化

2.1.1 檢測器的選擇

檢測的16種PAHs在紫外區(qū)都有吸收，二極管陣列檢測器能同時測定，但靈敏度比較低，對16種PAHs的檢出限約為1 μg/mL；而選擇用熒光檢測器靈敏度更高，除苊烯在熒光沒有響應(yīng)，其余15種PAHs檢出限可達到0.7 ng/mL；所以選擇了苊烯用二極管陣列檢測器進行檢測，其余15種PAHs用熒光檢測器進行檢測。

2.1.2 色譜柱的選擇

選用了PAHs的專用色譜柱Waters PAH C18，分離度明顯優(yōu)于普通C18色譜柱，且只需采用乙腈-水的梯度洗脫即可實現(xiàn)完全分離。配制濃度為50ng/mL的15種PAHs的分離色譜圖見圖1。

圖1 15種PAHs標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.1 Standard chromatogram of 15 PAHs

按照上述前處理方法提取后的方便面樣品圖譜見圖2，除苯并（g，h，i）芘未檢出外，其它 14 種 PAHs均有不同濃度的檢出。

圖2 樣品的液相色譜圖Fig.2 The liquid chromatogram of the sample

2.1.3 流動相的選擇

因15種PAHs中有許多是同分異構(gòu)體，要使這些同分異構(gòu)體在適宜的時間內(nèi)有效分離并峰形良好，采用了不同比例的乙腈和水進行梯度洗脫，結(jié)果表明：乙腈比例高時，目標(biāo)峰保留時間短，出峰快，峰行尖銳，但苊和芴分離不到基線；乙腈比例低時，分離效果好，但峰形拖尾嚴重；根據(jù)流動相對不同PAHs的洗脫能力以及色譜柱和梯度泵的最大承受壓力，反復(fù)調(diào)整，最后選擇了最優(yōu)化的梯度洗脫程序（表1）。苊烯用該梯度洗脫程序也分離良好。

2.1.4 檢測波長的選擇

熒光檢測器中化合物的激發(fā)波長和發(fā)射波長決定了該化合物的檢出限和靈敏度，故根據(jù)15種PAHs在不同波長下的響應(yīng)值及出峰時間，選擇了最佳的檢測波長程序。在該最佳波長程序下進行檢測，15種PAHs的靈敏度高，檢出限低，完全可以滿足方便面中PAHs的檢測。苊烯在紫外230 nm下相應(yīng)最高，因此選擇了230 nm進行測定。

2.2 固相萃取條件優(yōu)化

2.2.1 固相萃取柱的選擇

影響方便面中PAHs測定的主要因素是方便面中的極性脂類和脂肪等，GB5009.265-2016[11]《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中多環(huán)芳烴的測定》選用溶劑提取的方法，回收率和精密度均不理想。本方法選用了水可浸潤的反相吸附柱Oasis HLB，該柱由親水性的N-乙烯吡咯烷酮和親脂性的二乙烯基苯按特定比例聚合而成。它以特別的“極性鉤”為增強極性物的保留提供了優(yōu)異的反相保留容量，也由于這個“極性鉤”的存在而能保持很好的潤濕性，避免了意外干涸導(dǎo)致的回收率不高問題。與傳統(tǒng)的C18小柱相比，Oasis HLB具有更高的吸附容量，更高的保留能力，更寬的pH值適用范圍，更高的穩(wěn)定性，提高了樣品的回收率和精密度。

由于方便面基質(zhì)復(fù)雜，又選用了Sep-Pak Florsil正向吸附柱進行二次凈化，Sep-Pak Florsil的吸附劑是弗羅里硅土，是一種極性、高活性、弱堿性吸附劑，可以從非水相樣品溶液中吸附中等極性分析物，因此既可吸附多余的脂肪和色素等雜質(zhì)[12]，也可完全吸附待測物，再分別用不同極性溶劑進行洗脫，達到凈化待測物的目的。

2.2.2 萃取條件優(yōu)化

反相吸附柱Oasis HLB富集PAHs后，需要一種極性合適的溶劑能夠清洗雜質(zhì)并保留待測物，再選擇一種溶劑洗脫待測物，乙腈能夠清洗雜質(zhì)但洗脫不完全，丙酮的溶解性太強能夠完全清洗雜質(zhì)但會使少許待測物進入液相，二氯甲烷能夠?qū)Υ郎y物有最大溶解度。因此選擇先用乙腈∶丙酮（1∶1）進行清洗，能夠保持待測物的最大保留，再選用二氯甲烷洗脫，保證了雜質(zhì)的最大清洗和待測物的最大洗脫。

正向吸附柱Sep-Pak Florsil進行凈化時，需要一種極性較弱的有機溶劑才能保證待測物的最大保留和雜質(zhì)的最大洗脫，再用極性較強溶液洗脫待測物進行檢測。因此選用了正己烷清洗殘留的雜質(zhì)，正己烷∶二氯甲烷（2∶1）洗脫待測物。

2.3 線性范圍及檢出限

在本試驗條件下，按照1.2.1色譜條件進行測定，以峰面積對相應(yīng)的多環(huán)芳烴化合物質(zhì)量濃度作圖，所得的16種PAHs的線性方程，根據(jù)3倍信噪比的計算方法求得方法的最低檢出限，10倍信噪比的濃度為最低定量濃度。以取樣20 g樣品可制備4.0 g油脂，取2.0 g油脂進行凈化、濃縮最后定容至1.0 mL計，分別得到最低檢出限和最低定量限見表3。

表3 16種PAHs的高效液相色譜測定法的線性范圍、檢出限和定量限Table 3 The linear range，detection limit and quantitative limit of 16 PAHs for HPLC

2.4 加標(biāo)回收率和精密度

稱取20.0 g未檢出PAHs的方便面樣品于聚四氟乙烯離心管中，分別添加質(zhì)量濃度為1.0、5.0、10.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個水平6份，充分混勻，放置2 h后按照最佳前處理和色譜分析條件進行測定，回收率在75.8%～95.3%之間，RSD為2.87%～5.23%，結(jié)果見表4。

表4 16種PAHs的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 4 The recoveries and relative standard deviations of 16 PAHs

2.5 樣品測定

淄博市2016年共監(jiān)測隨機采集的山東省在售170份方便面樣品，本次檢測樣品覆蓋所有市場銷售的方便面品牌。其中苯并（a）芘檢出17份，檢出率10.0%，合格率100.0%；萘、菲檢出率最高達到98.8%，只有2份未檢出；蒽、熒蒽檢出率也較高在90.0%以上；苯并（g，h，i）芘、苊烯均未檢出，檢出率為 0。油炸型方便面的輕質(zhì)PAHs和重質(zhì)PAHs污染程度均高于非油炸型方便面；油炸型方便面的萘污染程度最高，高達65.9 μg/kg；非油炸型方便面的熒蒽污染程度最高，達到 37.5 μg/kg。

3 結(jié)論

通過對方便面樣品固相微萃取條件和色譜條件的優(yōu)化，選擇了最佳檢測條件，實現(xiàn)了對方便面中16種PAHs的同時測定，達到了很好的分離效果。該方法具有操作簡便、靈敏度高、檢出限低、線性范圍寬、雜質(zhì)干擾少及結(jié)果準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點。因方便面中干擾物復(fù)雜，選用Oasis HLB和Sep-Pak Florsil兩種固相萃取柱凈化，既能實現(xiàn)方便面中復(fù)雜干擾物的去除又能實現(xiàn)待測物的完全保留和洗脫，實現(xiàn)了HPLC對16種PAHs的完全分離檢測，滿足了方便面中PAHs的分析測試要求。

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