高效液相色譜法測定米酒中有機酸的含量

楊成聰，沈馨，馬雪偉，楊夢麗，董蘊，郭壯，*

（1.湖北文理學院食品科學技術學院鄂西北傳統發酵食品研究所，湖北襄陽441053；2.襄陽出入境檢驗檢疫局綜合實驗室，湖北襄陽441003）

作為一種酸甜適口的傳統發酵食品，米酒通常以糯米為主要原料，接入酒曲發酵而成[1]。米酒中的有機酸包括草酸、乙酸、乳酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸和酒石酸等，其通常由微生物發酵或后期添加形成[2]。適量的酸可以在米酒中起到調節和緩沖諸味的作用，但當酸度過高或過低時，均會造成米酒品質下降[3]。由此可見，有機酸作為米酒中重要的呈味物質，對米酒產品的滋味品質有著較大的影響，因而明確米酒中有機酸的種類及含量是極為必要的。

除酸堿滴定法外[4]，研究人員亦可以采用旋光法[5]、氣相色譜法（Gas Chromatography，GC）[6]和高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[7]對米酒中的有機酸含量進行測定。值得一提的是，雖然旋光法和酸堿滴定法較為經濟，但其準確度較低，重復性亦較差[8]。此外，因有機酸具有較高的沸點，不容易氣化，因而在使用氣相色譜法對其測定時，需先對檢測物進行衍生，方法較為復雜[9]。高效液相色譜法具有方法簡便快捷、分離度高、結果準確和對所測組分沸點沒有要求等優點，因而廣泛的應用于食品中有機酸的測定[10]。GB 5009.157-2016《食品安全國家標準食品有機酸的測定》采用該方法約束了果汁飲料及果汁、果味碳酸飲料、果凍、水果罐頭、膠基糖果、固體飲料、面包、餅干、糕點、烘焙食品餡料和生濕面制品中有機酸的測試方法。然而令人遺憾的是，米酒并不在上述約束范圍內。

本研究采用HPLC法對米酒中草酸、乙酸、乳酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸和酒石酸含量進行了測定，通過色譜條件的優化和方法性能的評價，實現了米酒中7種有機酸的快速分離和定量分析，為米酒生產廠家產品的自我檢測提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米酒：市售；草酸、乙酸、乳酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸和酒石酸標準品：西隴科學股份有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二銨和磷酸（均為分析純）：天津市北辰方正試劑廠；甲醇和異丙醇（均為色譜純）：國藥集團化學試劑有限公司；0.45 μm微孔濾膜：上海半島實業有限公司凈化器材廠。

LC-20ADXR高效液相色譜儀（配置有SIL-20A XR自動進樣器、LC-20AD XR四元低壓梯度泵、CTO-10AS vp柱溫箱、SPD-M20A二極管陣列紫外-可見光檢測器）、Inertsil ODS-SP C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）：日本島津公司；PGJ-10-AS 品冠純水機：武漢品冠儀器設備有限公司；2-6E小型臺式離心機：德國Sigma實驗室離心機股份有限公司；PHS-25型數顯pH計：上海儀電科學儀器有限公司；HHS-2數顯恒溫水浴鍋：長豐儀器設備廠；PS-100A超聲波清洗機：深圳市潔匯超聲洗凈設備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的處理方法

用天平稱取20.00 g試樣置于培養皿中，然后轉移至研缽中磨至粉碎，之后轉移至100 mL的容量瓶中，用流動相定容后靜置一段時間。將定容后的樣品轉移至離心杯中，12 000 r/min離心10 min，取上清液過0.45 μm微孔纖維素濾膜，濾液備用。

1.2.2 色譜條件的優化

1.2.2.1 供試樣品的制備

分別稱取草酸0.15g、蘋果酸0.30 g、檸檬酸0.60 g、酒石酸0.75 g以及乳酸、醋酸和琥珀酸各1.50 g溶解后于50 mL的容量瓶中定容，制成母液待用。

分別取各母液1.0 mL，再加入0.2 mL 1.0 mol/L的磷酸，用超純水定容至10 mL，混勻后作為供試樣品待用。

1.2.2.2 流動相中磷酸鹽的選擇

流動相：分別配制濃度均為0.01 mol/L的磷酸二氫鉀和磷酸氫二銨溶液，流動相中不添加乙腈，調節pH 值為 2.30；進樣量：20 μL；檢測器：SPD-M20A；色譜柱：InertsilODS-SPC18 色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30℃；流速：0.8 mL/min；檢測波長：215 nm。

1.2.2.3 流動相中磷酸鹽濃度選擇

流動相：分別配制0.01、0.05 mol/L和0.08 mol/L的磷酸二氫鉀溶液，流動相中不添加乙腈，調節pH值為 2.30；進樣量：20 μL；檢測器：SPD-M20A；色譜柱：InertsilODS-SPC18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30℃；流速：0.8 mL/min；檢測波長：215 nm。

1.2.2.4 流動相pH值的選擇

流動相：分別配制pH值為2.30、2.50和2.90，濃度為0.01 mol/L的磷酸二氫鉀溶液，流動相中不添加乙腈；進樣量：20 μL；檢測器：SPD-M20A；色譜柱：In ertsilODS-SPC18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30℃；流速：0.8 mL/min；檢測波長：215 nm。

1.2.2.5 流動相中乙腈比例的選擇

流動相：濃度為0.01 mol/L的磷酸二氫鉀溶液，分別設置乙腈和水相的體積比為0∶100、5∶95和10∶90；調節pH值為2.30；進樣量：20 μL；檢測器：SPDM20A；色譜柱：InertsilODS-SPC18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流速：0.8 mL/min；檢測波長：215 nm。

1.2.2.6 柱溫的選擇

分別設置柱溫為 25、30、35、40 ℃，流動相：濃度為0.01 mol/L的磷酸二氫鉀溶液，流動相中不添加乙腈，調節pH值為 2.30；進樣量：20 μL；檢測器：SPD-M20A；色譜柱：InertsilODS-SPC18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：0.8 mL/min；檢測波長：215 nm。

1.2.2.7 流速的選擇

分別設置流動相流速為0.5、0.8、1.0 mL/min和1.2 mL/min；流動相：濃度為0.01 mol/L的磷酸二氫鉀溶液，流動相中不添加乙腈，調節pH值為2.30；柱溫為 25 ℃；進樣量：20 μL；檢測器：SPD-M20A；色譜柱：InertsilODS-SPC18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長：215 nm。

1.2.3 米酒中7種有機酸的測定

1.2.3.1 米酒樣品的采集

從襄陽市武商廣場購物中心購買10種品名的米酒樣品，依次編號為MJ1～MJ10。

1.2.3.2 標準曲線的制作

分別稱取草酸0.15 g、蘋果酸0.30 g、檸檬酸0.60 g、酒石酸0.75 g以及乳酸、醋酸和琥珀酸各1.50 g分別溶解后于50 mL的容量瓶中定容，制成母液待用。分別吸取 0.1、0.2、0.5、1.0、1.4 mL，在加入 0.2 mL 1.0 mol/L 磷酸后，用流動相定容至10 mL。分別配制各個梯度的標準品溶液，溶液過0.45 μm濾膜待用。每個濃度重復進樣，分別以7種有機酸的濃度為自變量x，色譜峰面積的均值為因變量y，采用外標法進行標準曲線計算。

色譜條件：流動相：濃度為0.01 mol/L的磷酸二氫鉀溶液，流動相中不添加乙腈，調節pH值為2.30；進樣量：20 μL；檢測器：SPD-M20A；色譜柱：InertsilODSSPC18 色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：25℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：215 nm。

1.2.3.3 結果計算

米酒樣品中的有機酸含量按照以下公式進行計算：

式中：X為樣品中有機酸的含量，g/kg；C為由標準曲線求得樣品中某有機酸的濃度，μg/mL；V為樣品的最后定容體積，mL；m為樣品質量，g。

1.2.3.4 米酒中7種有機酸含量的測定

所有的試樣均按照1.2.1中的處理方法進行處理，按照1.2.3.2中的色譜條件進行測定，按照1.2.3.3中的計算方法進行計算。

1.2.4 方法性能評價

1.2.4.1 重復性試驗

取MJ5樣品2 mL于10 mL容量瓶中，加入0.2 mL 1 mol/L磷酸后定容。12 000 r/min離心10 min，上清液過0.45 μm濾膜后，按照1.2.3.1中的色譜條件進行7種有機酸峰面積的測定，試驗重復5次，同時對其相對標準偏差值（relative standard deviation，RSD）進行計算。

1.2.4.2 精密度試驗

將1.2.2.1中的供試樣品，不間斷進樣5次，色譜條件同1.2.3.2，分別對7種有機酸的峰面積進行測定，同時對其相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）進行計算。

1.2.4.3 加標回收率試驗

取MJ5樣品2 mL于10 mL容量瓶中，加入0.2 mL 1 mol/L磷酸后定容。12 000 r/min離心10 min，上清液過0.45 μm濾膜備用。濾液分為4份，1份不做任何處理，另外3份添加一定量的7種有機酸的混合溶液。色譜條件同1.2.3.2。

1.2.5 統計分析

使用島津高效液相色譜自帶軟件Labsolution將色譜圖轉化為數據矩陣后，利用Origin 8.5軟件（O－riginLab，MA，USA）作圖。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 流動相中磷酸鹽種類的選擇

在色譜柱為Inertsil ODS-SP C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm），柱溫為 30℃，流動相流速為0.8mL/min，pH值為2.30，流動相中不添加乙腈，磷酸鹽濃度為0.01 mol/L的固定條件下，分別選擇磷酸二氫鉀和磷酸氫二銨作為流動相中的磷酸鹽，探討了磷酸鹽種類對7種有機酸分離效果的影響，其結果如圖1所示。

由圖1可知，磷酸二氫鉀和磷酸氫二銨對7種有機酸分離效果的影響不大，但當緩沖鹽的種類選擇磷酸二氫鉀時，其基線要比磷酸氫二銨更平整，且噪音較小。綜上所述，本研究選擇磷酸二氫鉀作為流動相中的緩沖鹽。

2.1.2 流動相中磷酸鹽濃度選擇

在色譜柱為Inertsil ODS-SP C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm），柱溫為 30℃，流動相流速為0.8mL/min，pH值為2.30，流動相中不添加乙腈的固定條件下，分別配制磷酸二氫鉀的濃度為0.01、0.05、0.08mol/L，探討了磷酸二氫鉀濃度對7種有機酸分離效果的影響，其結果如圖2所示。

由圖2可知，磷酸鹽的濃度對7種有機酸的保留時間沒有較大的影響，但較高的鹽濃度會對色譜柱和整個流路系統造成損害，因此在其分離效果相同的條件下選擇磷酸二氫鉀的濃度為0.01 mol/L。

圖1 流動相磷酸鹽種類對7種有機酸分離效果的影響Fig.1 Effect of phosphate type of mobile phase on the separation of 7 kinds organic acids

圖2 流動相磷酸二氫鉀濃度對7種有機酸分離效果的影響Fig.2 Effect of monopotassium phosphate concentration in mobile phase on the separation of 7 kinds organic acids

2.1.3 流動相pH值的選擇

在色譜柱為Inertsil ODS-SP C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm），柱溫為30℃，流動相流速為0.8mL/min，流動相中不添加乙腈，磷酸二氫鉀濃度為0.01 mol/L的固定條件下，分別設置流動相的pH值為2.30、2.50和2.90，探討了流動相pH值對7種有機酸分離效果的影響，其結果如圖3所示。

由圖3可知，流動相的pH值會對7種有機酸的保留時間造成影響，當pH值為2.30時7種有機酸均可被較好的分離，但當pH值為2.50或2.90時，草酸和酒石酸的峰均不能很好的分開。值得一提的是，隨著流動相pH值的升高，部分有機酸的出峰時間出現縮短的情況。綜上所述，本研究選擇流動相pH值為2.30。

2.1.4 流動相中乙腈比例的選擇

在色譜柱為Inertsil ODS-SP C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm），柱溫為30℃，流動相流速為0.8mL/min，pH值為2.30，磷酸二氫鉀濃度為0.01 mol/L，分別設置乙腈與緩沖鹽溶液的體積比為0∶100、5∶95和10∶90，探討了流動相中乙腈比例對7種有機酸分離效果的影響，其結果如圖4所示。

由圖4可知，隨著乙腈體積比例的增加，各個有機酸的保留時間均相應縮短，當乙腈與緩沖鹽溶液的體積比是5∶95時，草酸、酒石酸、乳酸和乙酸均不能達到基線分離，當乙腈與緩沖鹽溶液的體積比是10∶90時，7種有機酸均不能達到基線分離。綜上所述，本研究選擇流動相中不添加乙腈。

圖3 流動相pH值對7種有機酸分離效果的影響Fig.3 Effect of pH of mobile phase on the separation of 7 kinds organic acids

圖4 流動相中乙腈比例對7種有機酸分離效果的影響Fig.4 The effect of acetonitrile percentage in mobile phase on the separation of 7 kinds organic acids

2.1.5 柱溫的選擇

在色譜柱為Inertsil ODS-SP C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm），流動相流速為0.8mL/min，pH值為2.30，流動相中不添加乙腈，磷酸二氫鉀濃度為0.01 mol/L的固定條件下，分別設置柱溫為25、30℃和35℃，探討了柱溫對7種有機酸分離效果的影響，其結果如圖5所示。

由圖5可知，柱溫的改變對7種有機酸分離效果的影響并不大，但隨著溫度的升高，色譜柱損傷亦隨之增大。綜上所述，本試驗最后選擇的柱溫為25℃。

2.1.6 流動相流速的選擇

在色譜柱為Inertsil ODS-SP C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫為 25 ℃，pH 值為 2.30，流動相中不添加乙腈，磷酸二氫鉀濃度為0.01 mol/L的固定條件下，分別設置流速 0.5、0.8、1.0、1.2 mL/min，探討了流動相流速對7種有機酸分離效果的影響，其結果如圖6所示。

由圖6可知，隨著流速的增加，有機酸的保留時間隨之提前。在保證分離效果和壓力適中的前提下，應盡可能快的使待檢測組分被檢出，進而達到縮短檢測時間的目的。綜上所述，本試驗最后選擇的流動相流速為1.0 mL/min。

圖5 柱溫對7種有機酸分離效果的影響Fig.5 Effect of column temperature on the separation of 7 kinds organic acids

圖6 流動相流速對7種有機酸分離效果的影響Fig.6 Effect of flow rate of mobile phase on the separation of 7 kinds organic acids

2.2 米酒中7種有機酸含量的測定

2.2.1 標準回歸方程

按照1.2.3.2中方法，分別以草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸7種有機酸的濃度為自變量x，色譜峰面積為因變量y，進行標準曲線回歸方程的計算，結果如表1。

由表1可知，7種有機酸線性回歸方程的相關系數均在0.9960以上。由此可見，各有機酸的濃度和峰面積之間具有良好的線性關系，這亦可間接證明本研究所采用的色譜條件可以實現米酒樣品中7種有機酸的精確定量。

表1 7種有機酸的回歸方程Table 1 Linear regression equations of detection for 7 kinds organic acids

2.2.2 米酒中7種有機酸含量的測定

取2 mL樣品加入0.2 mL 1 mol/L磷酸后，用流動相定容，12 000 r/min離心10 min后，上清液過0.45 μm濾膜后上機，按照1.2.3.2中的色譜條件對米酒中7種有機酸的含量進行測定，結果如表2所示。

2.3 方法性能研究

2.3.1 重復性試驗結果

按照1.2.1制作MJ5米酒樣品5份，5份樣品分別進樣，色譜條件同1.2.3.2，測定樣品中7種有機酸的含量，同時計算RSD。結果如表3所示。

表2 10個米酒樣品中7種有機酸的含量（n=3）Table 2 Contents of 7 kinds organic acids in 10 rice wine samples（n=3）

表3 重復性試驗Table 3 Result of repetitive test

由表3可知，7種有機酸的RSD值均在1.0%以下，由此可知，本試驗所采用的研究方法在測定上述7種有機酸時具有良好的重復性。

2.3.2 精密度試驗結果

準確吸取1.2.2.1節中7種有機酸的混合供試溶液，按照1.2.3.2節中的色譜條件進行測定，不間斷進樣5次，分別測量7種有機酸的峰面積和相對標準偏差值，其結果如表4。

由表4可知，7種有機酸的RSD值均在1.0%以下，由此可知，本試驗具有較好的精密性，可以滿足試驗要求。

表4 精密度試驗結果Table 4 Results of precision test

2.3.3 加標回收率試驗結果

按照1.2.4.3的樣品處理方法制作MJ5米酒供試樣品，同時按1.2.3.2中的色譜條件對樣品中7種有機酸的含量進行測定，其含量和加樣回收率結果如表5所示。

表5 加樣回收率試驗結果Table 5 Results of spike recovery test

由表5可知，7種有機酸的平均回收率在98.74%和101.00%之間，由此可見，HPLC法對米酒中7種有機酸含量測定時回收率較高，在試驗允許的范圍內，可以很好的滿足定量分析的要求。

3 結論

本研究建立了高效液相色譜法測定米酒中草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸7種有機酸的方法，其中檢測器為二極管陣列紫外-可見光檢測器，檢測波長215 nm，Inertsil ODS-SP C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫為 25℃，流動相為0.01 mol/L的磷酸二氫鉀溶液，pH值為2.30，流速為1.0 mL/min。

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