高效液相色譜同時檢測白酒中四大酸的方法

王 芳，廖勤儉，安明哲，練順才，李楊華，郭 艷

(宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓644007)

乳酸、乙酸、丁酸、己酸是濃香型白酒中四大主體酸酯，即乳酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯的前體物質，也是白酒香味成分。因乳酸為高沸點不揮發性酸，長期以來，此四大酸均參考國標芐基溴酯化氣相色譜檢測方法[1]，此方法前處理時間長，影響檢測效率。另有離子色譜法測此4種酸[2]，該方法的應用常出現乳酸和乙酸難以分離的問題，所以，針對白酒樣品，常常會進行上百倍的稀釋，從而加大了檢測誤差，出現樣品檢測結果不穩定的情況;也有以硫酸銅水溶液作為水相流動相，利用高效液相色譜法測定白酒中乳酸和乙酸的方法[3]。白酒企業中，常規的酸酯醇檢測大多采用氣相色譜法，因此，為緩解氣相色譜的檢測壓力，以及離子色譜針對高酸濃度樣品的檢測不穩定性，筆者利用高效液相色譜進行了乳酸、乙酸、丁酸、己酸的檢測方法研究，并驗證了方法在白酒酒尾樣品、己酸發酵液樣品檢測中的準確性，特別是己酸發酵液中4種酸的檢測，可以監控發酵的穩定性及發酵過程的原料轉化率及己酸產率。研究結果表明，該方法簡便適用，精確度高，重復性好。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：白酒酒尾及己酸發酵液由本實驗室自備。

乳酸、乙酸、丁酸、己酸標準品的配制：準確稱取色譜級乳酸、乙酸、丁酸、己酸，以70%的甲醇水溶液分別配制成50 mL濃度為10 g/L的標準儲備液放置于4℃中冷藏。

試劑：優級純磷酸、超純水、HPLC級甲醇。

儀器設備：美國Agilent公司1100高效液相色譜儀，DAD檢測器。

1.2 實驗方法

1.2.1 液相色譜條件

色譜柱：Agela公司VenusilASB C184.6×250 mm，5 μm。

柱溫：30℃。

紫外線檢測波長：214 nm。

流動相：A：甲醇；B：0.1%的磷酸水溶液。

梯度洗脫：0 min：100 B；8 min：100 B；25 min：10 B；28.5 min：10 B；29 min：100 B；35 min：100 B；停止：35 min；流速：1.0 mL/min。

1.2.2 樣品前處理

白酒酒尾樣品：取0.5 mL白酒樣品以0.1%的磷酸水溶液稀釋至1 mL，于2 mL離心管中，振蕩均勻，0.2 μm的膜過濾后作為待測樣品。

己酸發酵液：取0.1 mL己酸發酵液，以0.1%的磷酸水溶液稀釋至1 mL，于2 mL離心管中，振蕩均勻，0.2 μm的膜過濾后作為待測樣品。

2 結果與分析

2.1 標樣的檢測

分別取10 g/L的4種酸單標準溶液，以0.1%的磷酸水溶液稀釋至1000 mg/L的混合標準溶液，進行定性檢測。標準品液相色譜圖見圖1，4種酸的出峰時間見表1。

圖1 標準品液相色譜圖

表1 4種酸的出峰時間

2.2 標準曲線及線性范圍

分別取10 mg/L的4種酸單標準溶液，以0.1%的磷酸水溶液稀釋至100 mg/L、500 mg/L、1000 mg/L、1500 mg/L、2000 mg/L，5個濃度梯度，作為定量分析校正。以峰面積Y為縱坐標，以質量濃度（mg/L）為X橫坐標進行線性回歸，檢測結果見表2。

表2 標準曲線結果

2.3 白酒酒尾樣品中4種酸的精密度、回收率

取白酒酒尾樣品，其中一份經1.2.2中方法處理后，作為空白樣品；另兩份分別加入已知量的4種酸單標準溶液，經1.2.2中方法處理后，進行回收率測定；同時對空白樣品進行精密度測定，檢測結果見表3。白酒酒尾空白樣品色譜圖見圖2。

圖2 白酒酒尾空白樣品色譜圖

2.4 己酸發酵液樣品中4種酸的精密度、回收率

取己酸發酵液樣品，其中一份經1.2.2中方法處理后，作為空白樣品；另兩份分別加入已知量的4種酸單標準溶液，經1.2.2中方法處理后，進行回收率測定；同時對一加標樣品進行精密度測定，檢測結果見表4。

表3 白酒酒尾樣品中4種酸檢測結果

表4 己酸發酵液樣品中4種酸檢測結果

3 結果與討論

該方法中水相流動相中加入適量的磷酸有助于乳酸和乙酸的分離和保證樣品檢測的穩定性、準確性。方法中白酒酒尾樣品，酒精度在15%vol左右，樣品中乙醇的濃度對乙酸和乳酸的分離有影響，經磷酸水溶液稀釋后，能保證樣品中乳酸峰和乙酸峰的有效分離。己酸發酵液樣品中乙酸、丁酸、己酸濃度相對較高，且含有一定的鈣鹽、鈉鹽，經磷酸水溶液進行十分之一的稀釋，可以將溶液中的有機酸鹽轉化成酸，保證樣品檢測的準確性。

方法采用214 nm的DAD檢測波長，梯度洗脫的方式,隨著流動相中有機相濃度的增高，基線有一定的向上漂移，但對樣品中4種酸的定性定量檢測沒有影響。

方法中，4種酸的定量檢測限均為10 mg/L，線性相關系數R2值為0.9996～0.9999，白酒酒尾樣品中的回收率為94.3%～100.5%，檢測結果的RSD為1.29%～3.67%。己酸發酵液樣品中的回收率為96.6%～101.9%，檢測結果的RSD為1.28%～3.02%，滿足分析要求。

該方法簡單、適用，可以緩解白酒企業氣相色譜和離子色譜的檢測壓力。

[1]中國輕工業聯合會.食品添加劑乳酸：GB 2023—2003[S].北京：中國標準出版社,2003.

[2]郭逸臻,石敏.離子色譜法測定白酒中乳酸含量的方法研究[J].釀酒科技,2008(9)：108-110.

[3]馮向東.高效液相色譜法測定白酒中乳酸和乙酸含量[J].釀酒科技,2009(5)：115-116.