白酒黃水中提取乳酸鏈球菌素的研究

李 覓 ，張 磊 ，孫中理 ，郭 杰 ，余 航 ，常少健 ，唐賢華 ，王 晗

(1.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設計院，四川成都611130； 2.釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川成都611130； 3.國家固態(tài)釀造工程技術研究中心，四川瀘州646000； 4.四川工商職業(yè)技術學院，四川成都611830； 5.四川理工學院，四川自貢643000)

乳酸鏈球菌素（Nisin）可抑制大多數(shù)革蘭氏陽性細菌，對芽孢桿菌的孢子有強烈抑制作用[1]。因此，作為食品防腐劑廣泛應用于食品行業(yè)，對食品的色、香、味、口感等無不良影響，且食用后不會改變人體腸道內正常菌群，更不會與其他抗菌素出現(xiàn)交叉抗性，是一種高效、無毒、安全、無副作用的天然食品防腐劑[2]。

以黃水為主的固態(tài)釀造廢水中存在大量的乳酸菌[3]，乳酸菌在發(fā)酵代謝過程中除產生乳酸、乙酸等有機酸外，還產生大量的有抑菌或殺菌作用的乳酸鏈球菌素[4]。利用大孔吸附樹脂對黃水中的乳酸鏈球菌素進行粗提取，研究樹脂添加量、提取時間、轉速、提取溫度等因素對提取效果的影響，以確定乳酸鏈球菌素的最適合提取條件[5]，為釀酒廢水的資源化利用提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

菌株：藤黃微球菌（釀酒生物與技術四川省重點實驗室提供）。

試劑及耗材：大孔吸附樹脂（NAK-Ⅱ，天津南開大學樹脂有限公司），乳酸鏈球菌素Nisin標準品（106 IU/g，Sigma），乙腈（色譜純，Sigma），三氟乙酸、葡萄糖、乙醇、NaCl、HCl、Na2HPO4·12H2O（AR，成都科龍化工試劑廠），瓊脂粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏（BR，北京奧博星）。

儀器設備：電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠；分析天平，梅特勒托利多；高效液相色譜（1260），美國Agilent；旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；振蕩培養(yǎng)器，上海博訊；高溫滅菌鍋，上海申安。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取工藝[6-8]

預處理：將黃水粗濾，除去酒糟、稻殼等雜質，5000 r/min離心，除去沉淀。

提取：預處理后的黃水加入大孔吸附樹脂（樹脂使用前按照說明書預處理），置于搖床提取一定時間，收集樹脂，加入80%、pH2的乙醇解吸后，收集清液旋轉蒸發(fā)去溶劑，加入0.02 mol/L的鹽酸溶液溶解，得到粗提液。

1.2.2 效價測定[9-10]

（1）指示菌：藤黃微球菌

（2）營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，瓊脂1.5%，pH7.0。

（3）效價檢測培養(yǎng)基（g/100 mL）：蛋白胨0.8，葡萄糖0.5，酵母浸膏0.25，氯化鈉0.5，瓊脂粉1，1%Na2HPO4·12H2O，pH7.0，121 ℃滅菌20 min。

（4）標準曲線繪制

準確稱取100 mg Nisin標準品，溶于10 mL無菌0.02 mol/L的鹽酸稀溶液中，配成104 IU/mL的Nisin儲備液。取Nisin儲備液，以0.02 mol/L無菌鹽酸為稀釋液，制備濃度為1000 IU/mL、500 IU/mL、250 IU/mL、100 IU/mL、50 IU/mL、10 IU/mL的Nisin工作液。

將檢測培養(yǎng)基熔化并冷卻至50℃左右，用移液管移取15 mL到無菌平皿中，使其在培養(yǎng)基均勻涂布，放置在水平臺上凝固后，作為底層平板；另取檢測培養(yǎng)基適量，熔化后冷卻至45℃左右，加入制好的菌懸液使最終濃度在107～108cfu/mL，迅速搖勻，用移液管移取5 mL在底層上均勻涂布，作為菌層。置水平臺上冷卻后將牛津杯均勻直立于培養(yǎng)基上。加入200 μL不同濃度工作液于每個牛津杯中，30℃培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑。

（5）提取樣品效價測定

取200 μL粗提液按繪制標準曲線法測定。

1.2.3 單因素試驗

設計單因素試驗，以提取物效價評估提取效果，分別研究樹脂添加量、提取溫度、提取時間、轉速等條件對提取效果的影響。

樹脂添加量選擇：在30℃條件下，向黃水中分別添加0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%樹脂，于搖床100 r/min，提取6 h。研究樹脂添加量對提取效果的影響。

提取溫度選擇：向黃水中添加1.5%樹脂，分別在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃條件下，于搖床100 r/min，提取6 h。研究溫度對提取效果的影響。

提取時間選擇：在30℃條件下，向黃水中添加1.5%樹脂，搖床100 r/min分別提取6 h、12 h、18 h、24 h、30 h。研究提取時間的影響。

轉速選擇：在30℃條件下，向黃水中添加1.5%樹脂，搖床分別以 50 r/min、100 r/min、150 r/min、200 r/min、250 r/min的轉速提取6 h。研究轉速對提取效果的影響。

1.2.4 正交優(yōu)化

以提取物效價評估提取效果，設計L9（34）正交試驗進一步優(yōu)化提取條件。正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平

1.2.5 高效液相色譜條件定性[11]

粗提液用0.22 μm膜過濾后，用高效液相色譜定性。

色譜柱：C18柱，檢測器：二極管陣列檢測器，波長：220 nm，流速：1.5 mL/min，柱溫：25 ℃，進樣量50 μL，流動相：A（90%乙腈+0.1%三氟乙酸）、B（10%乙腈+0.1%三氟乙酸）。

2 結果與分析

2.1 標準曲線繪制

以抑菌圈直徑為橫坐標，乳酸鏈球菌素效價對數(shù)值為縱坐標繪制標準曲線，如圖1所示。R2=0.9965，線性較好，滿足試驗需求。

圖1 乳酸鏈球菌素標準曲線

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 樹脂添加量影響（見圖2）

圖2 樹脂添加量對提取效果的影響

由圖2可知，隨著樹脂添加量的增加，提取物的效價逐漸提升，說明樹脂量越大，吸附的乳酸鏈球菌素越多。樹脂添加量從0.5%到1.5%，乳酸鏈球菌素吸附量增加幅度較大，樹脂添加量從1.5%到2.5%，乳酸鏈球菌素吸附量增加幅度較小。可能是因為黃水中一定量的乳酸鏈球菌素被樹脂吸附，含量明顯降低，低到一定程度，樹脂無法吸附。

2.2.2 提取時間影響（見圖3）

圖3 提取時間對提取效果的影響

如圖3可知，隨著提取時間的延長，乳酸鏈球菌素的提取量逐漸增加，18～24 h范圍內增加幅度較大，之后趨于平緩，說明樹脂對乳酸鏈球菌素的吸附達到飽和。

2.2.3 轉速影響（見圖4）

圖4 轉速對提取效果的影響

如圖4所示，在50～150 r/min范圍內，增加轉速，可以使乳酸鏈球菌素的提取量增加，但繼續(xù)增加轉速，會引起乳酸鏈球菌素提取量一定程度的降低，最終趨于平緩。一定范圍內增加轉速可以使乳酸鏈球菌素分子與吸附劑樹脂充分接觸，有利于吸附。但轉速過高，可能會因機械力的作用而對吸附造成不利影響。

2.2.4 溫度影響（見圖5）

圖5 溫度對提取效果的影響

由圖5可知，在20～40℃范圍內，隨著溫度升高，乳酸鏈球菌素吸附量增多，在40～60℃范圍，隨著溫度升高，乳酸鏈球菌素吸附量減少。溫度升高，分子運動加劇，增加乳酸鏈球菌素分子與吸附劑樹脂的碰撞機會，一定溫度范圍內升高溫度，吸附量增加；但吸附本身是放熱過程，溫度升高，樹脂的吸附能力降低。

2.3 正交試驗結果

根據(jù)單因素試驗結果，設計4因素3水平正交試驗，進一步優(yōu)化乳酸鏈球菌素的粗提取條件，正交試驗結果與分析見表2。通過對比極差R可以看出，影響乳酸鏈球菌素提取效果的因素：樹脂添加量＞提取溫度＞提取時間＞轉速。通過比較均值k可以看出，乳酸鏈球菌素最優(yōu)提取條件組合為A2B2C3D3，通過驗證試驗發(fā)現(xiàn)提取條件為A2B2C3D3時，效價為572.02 IU/mL，因此乳酸鏈球菌素最合適提取條件為：樹脂添加量1.5%，提取溫度50℃，提取時間24 h，轉速150 r/min。

表2 L9(34)正交試驗結果與分析

2.4 高效液相色譜分析定性結果（圖6、圖7）

圖6 乳酸鏈球菌素標準品的色譜分析

圖7 粗提取樣品的色譜分析

采用高效液相色譜對粗提取物進行定性，乳酸鏈球菌素標準品出峰時間在9.413 min，粗提取物在9.420 min時出現(xiàn)了一個特征峰，從保留時間的一致性可以初步判定粗提取物為乳酸鏈球菌素，但粗提取物仍存在較多雜質，需進一步純化。

3 結論

通過正交試驗探究了大孔吸附樹脂添加量、提取時間、轉速、提取溫度對黃水中乳酸鏈球菌素粗提取的影響，結果表明影響因素的順序為樹脂添加量＞提取溫度＞提取時間＞轉速。乳酸鏈球菌素最合適提取條件為：樹脂添加量1.5%，提取溫度50℃，提取時間24 h，轉速150 r/min，粗提取物效價為572.02 IU/mL。

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