烏藥醇提取物抗慢性酒精性肝損傷量效關系研究

汪洋鵬 劉磊 張光霽 何志剛 樓招歡?

烏藥為樟科植物烏藥的干燥塊根。為現行《中國藥典》收載的品種，含有揮發油、異喹啉生物堿及呋喃倍半萜及其內酯三大類，具有行氣止痛，溫腎散寒等功效［1］。近年研究發現，烏藥能有效降低CCL4、乙硫氨酸所致肝損傷動物血清轉氨酶水平，保護肝臟免受脂肪浸潤［2］。烏藥不同提取物能顯著降低酒精性肝損傷模型大鼠血清TC、TG、ALT、AST含量，改善肝組織病理學改變，其中以烏藥醇提取的作用相對較優［3-4］。2016年10月至12月作者通過實驗研究，觀察不同劑量烏藥乙醇提取物對慢性酒精性肝損傷模型動物血生化指標及炎癥因子水平的干預作用，為進一步研究烏藥抗酒精性肝損傷作用及機制提供劑量參考。

1 材料與方法

1.1 動 物 體 重18～20g的 雄 性ICR小 鼠， 購自浙江省實驗動物中心，動物質量合格證號：NO.1610100014，許可證號：SCXK（浙）2014-0001。在室溫（23±2）℃，相對濕度 50%～70%飼養環境飼養，自由飲水飲食。

1.2 藥物與試劑 烏藥醇提取物制備：取烏藥飲片（浙江中醫藥大學中藥飲片廠），加入10 BV量70%（v/v）乙醇，回流提取2次，提取液合并，減壓回收并濃縮至適當體積，用蒸餾水配制成烏藥濃度為4g/kg、2g/kg、1g/kg、0.5g/kg、0.2g/kg、0.1g/kg，分裝后放置冰箱內保存，獲得不同劑量的烏藥醇提取物；陽性對照-易善復：易善復膠囊溶于蒸餾水中，用超聲波乳化，制成2.05mg/ml的乳劑。造模試劑：紅星二鍋頭酒（酒精度52%，北京紅星股份有限公司）用時與純水按一定體積比例稀釋至所需灌胃濃度。ALT（16052001）、AST（16091901）、TC（15100801）、TG（16030301）、HDL-C（16031401）試劑盒購自寧波美康生物科技股份有限公司；IL-6（220661232）、IL-1β（2201B61232）ELISA試劑盒購自聯科生物技術有限公司。

1.3 儀器 Powerwave340酶標儀，美國Bio-TEK公司；TBA-40FR全自動生化儀，日本東芝醫療系統株式會社；XHF-D高速分散器，寧波新芝生物科技股份有限公司；Heraeus Biofuge Stra冷凍離心機，德國Heraeus；wh-861渦懸混合器，太倉市科教器材廠；DS-671電子計重秤，上海寺岡電子有限公司。

1.4 方法 （1）模型復制及給藥：取ICR小鼠，按體重隨機分為9組，即正常對照組、模型對照組、易善復對照組（205.2mg/kg）、烏藥醇提取物4g/kg組、烏藥醇提取物2g/kg組、烏藥醇提取物1g/kg組、烏藥醇提取物0.5g/kg組、烏藥醇提取物0.2g/kg組、烏藥醇提取物0.1g/kg組，每組各8只。所有小鼠均給予基礎飼料，自由飲水飲食。除正常對照組外，其余各組小鼠于每天上午8：00灌胃，按0.1ml/10g體重量給予不同濃度白酒，在2周內白酒濃度，按30%～45%遞增，連續灌胃4周復制慢性酒精性肝損傷模型。從造模第l天起，除正常對照組和模型對照組灌服蒸餾水外，其余各給藥組分別灌胃相應的藥物，1次/d，連續6周。（2）指標檢測：①一般行為學觀察：觀察毛發、飲食狀況、運動情況，體重測定1次/3d。②血液生化學指標及氧化指標的影響：于造模2、4、6周采血，3500 r/min離心10min，分離血清，全自動生化儀測定血清 ALT、AST、TC、TG、HDL-C水平。③血清炎癥因子水平檢測：于造模 4、6 周采血，離心制備血清，ELISA 法測定血清中IL-1β、IL-6水平。④肝臟指數檢查：實驗期末，解剖小鼠后，快速分離肝臟，血漬用冰生理鹽水洗凈，濾紙吸干血漬，稱量肝臟質量，計算肝指數。

1.5 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件。計量資料（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對ALI模型小鼠體重及肝指數的影響 與正常組比較，隨著造模時間的延長，ALI小鼠體重呈逐漸下降趨勢，其中第2、4、6周差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型比較，烏藥各組小鼠體重有上升趨勢，其中烏藥1g/kg組第6周差異有統計學意義（P＜0.01）；其余各組間差異無統計學意義（P＞0.05）。與正常組比，ALI小鼠肝臟指數顯著增大（P＜0.05）；與模型組比，不同劑量烏藥組小鼠肝臟指數差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖 1。

圖1 不同劑量的烏藥醇提取物對ALI小鼠體重（A）以及肝臟指數（B）的影響。

2.2 對模型小鼠肝功能指標的影響 與正常組比較，自第2周起，ALI小鼠血清ALT、AST活性隨著造模時間的延長而顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，自造模第4周起，不同劑量烏藥醇提物均能有效降低模型小鼠ALT、AST活性，其中ALT以2g/kg、1g/kg、 0.2g/kg的烏藥組作用較為顯著（P＜0.05），0.5g/kg、0.2g/kg、0.1g/kg在6周后降低AST活性明顯（見圖 2）。

圖2 不同劑量的烏藥醇提取物對ALI小鼠肝功能指標的影響

2.3 對模型小鼠血脂水平的影響 與正常對照組比較，ALI小鼠血清TC、HDL-C隨著造模時間的延長而逐漸降低趨勢。TG水平在2、4周中有上升趨勢，在第6周后有所下降，但差異無統計學意義。與模型組比較，不同劑量烏藥組間差異無統計學意義（見圖3）。

圖3 不同劑量的烏藥醇提物對ALI小鼠血脂水平的影響

2.4 對模型小鼠血清炎癥因子水平的影響 在造模第4、6周，ALI小鼠與正常組小鼠相比血清IL-6、IL-1β水平均升高（P＜0.01）；用藥組與模型組比，在第4、6周，不同劑量烏藥均能降低ALI小鼠血清IL-6水平（P＜0.01），其中，以1g/kg、0.1g/kg劑量組在第4周作用相對顯著。以2g/kg、0.5g/kg、0.2g/kg、0.1g/kg烏藥醇提物能降低IL-1β水平（P＜0.01），其中，以第6周0.5g/kg烏藥醇提物最為明顯。4g/kg、1g/kg烏藥醇提物對IL-1β水平有上升作用（見圖4）。

圖4 不同劑量烏藥醇提物對ALI小鼠血清炎癥因子水平的影響

3 討論

在以往的研究過程中可知酒精性肝損傷中存在脂代謝紊亂和轉氨酶活性改變，血清ALT、AST活性及TG、HDL-C水平是急慢性酒精性肝損傷的敏感觀察指標［5-6］。慢性酒精性肝損傷中，ALT、AST等動態指標水平的高低直接反映肝損傷的程度，為診斷和用藥提供方便。在本實驗中，模型小鼠血清在2、4、6周后血清ALT、AST都呈現出上升的趨勢，給予不同劑量烏藥醇提物干預4周后，能不同程度降低ALT、AST水平，其中以1g/kg、0.5g/kg、0.2g/kg烏藥組降低ALT、AST水平較為明顯。模型小鼠血清TC、HDL-C水平在造模第2周后下降；血清TG水平呈現先升后降變化，提示模型小鼠存在脂質代謝紊亂現象。在實驗后期，0.5g/kg、0.2g/kg、0.1g/kg烏藥醇提物組顯示拮抗HLD-C下降作用，提示這三個劑量烏藥醇提取物對酒精性肝損傷的后期有調節作用。

過量酒精攝入產生的腸源性內毒素可活化NF-κB炎癥信號通路，誘導TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥介質產生，促進酒精性肝損傷的發生和進展［7-8］。在本實驗中，模型小鼠的IL-1β、IL-6水平在第4周后，呈遞增的趨勢；與模型組比較，不同劑量烏藥組均能降低IL-6水平，其中1g/kg組在4、6周較為明顯，0.1g/kg組在4周時較為顯著。2g/kg、0.5g/kg、0.2g/kg、0.1g/kg烏藥醇提物組能降低IL-1β水平，其中以0.5g/kg烏藥醇提物組最為顯著。

綜上所述，烏藥醇提取物具有抗慢性肝損傷的作用，但不同劑量烏藥醇提物對慢性肝損傷的側重點、強度和時間上有所側重。深入系統的成分結合藥效，有助于進一步研究烏藥對酒精性肝損傷的作用與藥效成分，促進臨床藥品的研發。

［1］ 中國藥典委員會.中華人民共和國藥典2015版. 中國醫藥科技出版社,北京. 2015:138.

［2］ 陳偉民, 王軍偉, 朱瑋華. 烏藥提取物對大鼠急性酒精性肝損傷預防作用的抗氧化機制研究. 中國醫刊, 2013, 48(1).

［3］ 陳卓亮, 王軍偉, 譚明明,等. 烏藥不同提取部位對大鼠急性酒精性肝損傷的保護作用研究. 浙江中醫雜志, 2014, 49(7):538-539.

［4］ 聶子文, 郭建生, 陳君, 等. 烏藥不同提取部位對小腸推進, 胃排空的影響. 中藥藥理與臨床, 2011, 27(2): 93-95.

［5］ 趙敏,黃俊明,譚劍斌,等. 小鼠急性酒精性肝損傷模型的動態研究. 毒理學雜志,2010,24(5):378-380.

［6］ 劉明,陳紹紅,鐘贛生,等.葛花枳椇子配伍對酒精性肝損傷大鼠肝臟功能及病理形態的影響.南京中醫藥大學學報,2015,31(2):147-151.

［7］ Petrasek J,Mandrekar P,Szabo G.Toll-like receptors in the pathogenesis of alcoholic liver disease. Gastroenterol Res Pract,2010:70-80.

［8］ Szabo G. Gut-liver axis in alcoholic liver disease. Gastroenterology,2015, 148(l):30-36.