分子印記聚合物仿生抗體用于酶聯免疫吸附法檢測恩諾沙星

呂春暉,劉 皓,方國臻,王 碩

(1.天津現代職業技術學院,天津 300350;2.天津科技大學,天津 300222)

恩諾沙星(ENRO)是氟喹諾酮類藥物中第一個畜禽專用獸藥,具有廣譜抗菌性,體內分布廣、消除速率慢、組織滲透力強、高效價廉,被廣泛應用于畜禽產品,各國均對動物性食品中恩諾沙星的最大殘留限量有嚴格規定[1-2]。目前用于食品中恩諾沙星殘留檢測的方法有微生物法[3-4]、高效液相色譜法[5-6]、液相色譜-質譜聯用法[7-8]、毛細管電泳法[9]、免疫分析法[10-12]等。與其它方法相比,免疫分析法不需要復雜的樣品前處理,不需昂貴儀器設備、操作簡便省時,易于推廣,適用于現場進行獸藥殘留的快速篩選檢測。但是由于抗體本身存在缺點,如制備繁瑣、需要犧牲動物、對溫度、濕度等環境敏感、不可重復利用等,影響免疫分析的廣泛應用。針對這種現實情況,開發建立一種準確、靈敏、快速、經濟的仿生免疫分析方法檢測恩諾沙星對于我國食品安全管理與指導畜牧業生產養殖合理用藥具有重要的現實意義。將分子印跡聚合物(MIP)作為人工抗體取代生物抗體已有研究[13-16],其與生物抗體相比制備簡單、不需犧牲動物、有更好的穩定性和耐用性等優點。

本文采用表面印跡法,在96孔酶標板表面直接合成恩諾沙星分子印跡聚合物膜,并將其用于恩諾沙星的檢測,旨在建立一種準確、靈敏、快速、經濟的仿生酶聯免疫分析法檢測恩諾沙星,進一步開拓分子印跡免疫分析技術在獸藥殘留檢測領域中的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

恩諾沙星 純度≥99.9%,中國食品藥品檢定研究院;雞胸肉 市購；甲基丙烯酸(MAA) 分析純,天津市北方天醫化學試劑廠;乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA) 分析純,美國Sigma公司;N,N-二甲基甲酰胺(DMF) 分析純,天津市北方天醫化學試劑廠;辣根過氧化氫酶(HRP) 酶活≥250 U/mg色譜純,美國Roche公司;N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),純度≥99%、偶氮二異丁腈(AIBN) 化學純,Sigma-Aldrich公司;N,N′-二環己基碳二亞胺(DCC) 純度≥98%,Sigma-Aldrich公司。

Thermo Labsystems,Multiskan Specbium酶標儀 美國Thermo公司;1575型微孔板清洗器 美國BIO-RAD公司;單道微量可調移液器和8道微量可調移液器 法國Gilson公司;QL-901型振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;RE-3000旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;LC-20A高效液相色譜儀 RF-10AXL熒光檢測器 日本島津公司;C18色譜柱(4.6 mm×150 mm) 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 恩諾沙星分子印跡聚合物膜的制備 準確稱取0.36 g(1 mmol)恩諾沙星,均勻溶解于溶劑(甲醇/甲苯,3∶1,V/V)中,緩慢滴加340 μL(4 mmol)功能單體 MAA,室溫下磁力攪拌2 h以使模板分子與功能單體充分自組裝形成模板分子-功能單體復合物,隨后緩慢滴加3 mmol交聯劑EDMA,磁力攪拌30 min后,加入50 mg引發劑AIBN,待其完全溶解,將圓底燒瓶放入超聲清洗器中脫氣5 min。用微量移液器將預聚合溶液加入到96孔酶標板表面,每孔50 μL,置于真空干燥箱中45 ℃熱引發聚合12 h,連續超聲振蕩洗脫12 h(換三次洗脫液)至洗脫液中檢測無恩諾沙星即為洗脫干凈,經37 ℃干燥,即得到恩諾沙星分子印跡聚合物(MIP)膜[17]。見圖1所示合成路線。

圖1 恩諾沙星分子印記聚合物膜的合成路線

作為對照,非印跡聚合物(NIP)膜在與1.2.1同樣的制備條件與步驟下合成,不添加模板分子恩諾沙星。

1.2.2 恩諾沙星分子印跡聚合物膜的表征及結合性能實驗 參見呂春暉等[18]方法進行紅外光譜分析及電鏡掃描結構分析，確定印跡聚合物膜的合成,進行吸附平衡結合實驗與吸附動力學實驗,并采用Scatchard分析來評價分子印跡聚合物對模板分子的結合特性,并確定平衡鍵合常數以及鍵合位點數目。結果表明,合成的聚合物膜可以應用于競爭性免疫吸附分析。

1.2.3 酶標記半抗原的合成 采用傳統活化酯法。根據王忠斌[19]的方法進行酶標抗原的合成:精確稱取恩諾沙星8.9 mg溶于150 μL DMF,加入3.5 mg NHS和12.4 mg DCC,混合溶液室溫下緩慢輕攪8 h,離心除去沉淀。冰浴條件下,將上層清液(活化酯溶液)緩慢滴加到溶有10 mg HRP的碳酸氫鈉(3 mL,130 mmol/L,pH=8.1)溶液中,4 ℃下攪拌反應過夜,之后將反應液于4 ℃在磷酸緩沖鹽溶液(pH=9.3,PBS)中透析(截留分子量14000 Da)3 d。收集透析后的酶標溶液,加入等體積的甘油,置于-20 ℃冰箱內保存備用。

1.2.4 酶標抗原稀釋度的選擇 將連接好的酶標抗原原液從1∶500開始進行3 倍梯度稀釋,每孔加入100 μL 酶標稀釋液,室溫孵育1 h。1 h 后棄去酶標稀釋液,用磷酸鹽緩沖溶液(PBST：由pH=7.5的PBS配制)洗板5 次。每孔再加入150 μL 底物顯色液,顯色30 min。30 min 后每孔加入50 μL 終止液。每孔吸出150 μL 顯色后的溶液立即在雙波長方式(450～650 nm)下用酶標儀讀取吸光度值讀數。選擇對應的吸光度值在0.8～1.2 之間的酶標稀釋度就是后續直接競爭反應所用的酶標溶液稀釋倍數。

1.2.5 標樣稀釋度pH的確定 分別在pH為4.5、5.5、6.5、7.5、8.5的PBS中進行競爭免疫反應，計算IC50以評價靈敏度，以適應辣根過氧化物酶的最適pH。

1.2.6 直接競爭仿生ELISA方法步驟 直接將恩諾沙星標準溶液或樣品提取液添加到各孔中,每孔添加100 μL,再加入100 μL稀釋后的酶標抗原溶液,以不含恩諾沙星的PBS溶液或樣品提取液的孔作為空白,室溫下置于水平振蕩器上振搖1 h,進行競爭反應,用洗滌液洗板5次,每孔分別加入150 μL配制好的底物溶液,顯色30 min后,加入50 μL終止液終止反應,立即將樣液在雙波長(450～650 nm)方式下用酶標儀測定吸光度值。

1.2.7 ELISA標準曲線的建立 用PBS(pH=7.5)溶液將恩諾沙星儲備液稀釋為10000、1000、100、10、1、0.1 μg/L標準溶液。按1.2.4步驟進行直接競爭反應得到一系列吸光度值。

按照公式(1)計算出不同濃度的恩諾沙星標準溶液在競爭反應中的抑制率值:

式(1)

式中：IC(%)-恩諾沙星對抗原抗體結合反應的抑制率;A對照-僅加酶標溶液的平均吸光度值;A樣品-恩諾沙星標準溶液或樣品提取液的平均吸光度值;A空白-不加酶標及恩諾沙星標準溶液的平均吸光度值。

以抑制率為縱坐標,恩諾沙星標準溶液濃度的對數值為橫坐標繪制標準曲線,每次實驗前均需重新繪制。

1.2.8 樣品添加回收實驗及液相驗證 準確稱取三份各2.0 g雞胸肉組織樣品,分別加入0.5 mg/L恩諾沙星標準溶液300、60、10 μL,渦旋振蕩5 min,充分混勻后靜置10 min。加入提取液10 mL,渦旋振蕩5 min,于4 ℃條件下4000 r/min離心15 min,將上清液轉移至50 mL離心管中,重復上述提取步驟,合并兩次上清液進行液液萃取,加入10 mL正己烷萃取3 min,靜置分層取下層清液,重復萃取兩次,50 ℃下旋轉蒸干,用1 mL PBS(pH=7.5)復溶,過0.45 μm濾膜過濾,4 ℃下保存待測。

三份豬尿樣也分別加入0.5 mg/L恩諾沙星標準溶液300、60、10 μL,渦旋混勻后,直接經0.45 μm濾膜過濾,4 ℃下保存待測。

色譜條件為:色譜柱:C18(150 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫箱溫度:30 ℃;檢測器:熒光檢測器;激發波長:280 nm;檢測波長:450 nm;流動相:0.05 mol/L磷酸溶液∶乙腈(80∶20,V/V);流速:0.8 mL/min;進樣量:20 μL。

1.3 數據處理

選擇8種恩諾沙星的結構類似物分別進行仿生ELISA分析,通過計算出的交叉反應率(CR%)(見公式2)來評價方法的選擇性,交叉率越小說明方法選擇性越好、特異性越強。

CR(%)=[IC50(恩諾沙星)/IC50(恩諾沙星結構類似物)]×100

式(2)

所有的測量數據都重復測量三次,結果用平均值和標準偏差來表示。制作ELISA標準曲線,以抑制率為15%時對應的恩諾沙星標準溶液濃度評價方法檢出限,抑制率為50%時對應的恩諾沙星標準溶液濃度評價方法靈敏度。

2 結果與分析

2.1 酶標濃度的選擇

將合成好的酶標探針從1∶500的比例開始進行梯度稀釋,其中以不加酶標探針溶液為空白,其余各行分別加入不同稀釋度的酶標探針溶液,以PBS代替恩諾沙星標準溶液進行免疫反應。為了使檢測結果準確靈敏,選擇吸光度值在0.8～1.2之間的酶標稀釋度作為直接競爭仿生ELISA方法的酶標溶液稀釋度數,即以1∶4000的比例作為酶標溶液稀釋度數。

2.2 標樣稀釋液pH的確定

不同pH下的IC50結果如圖2,在pH為7.5時,IC50最小,即方法靈敏度最高。在此pH溶液中,恩諾沙星(pKa1=5.94±0.09,pKa2=8.70±0.44)[20]能夠保持兩性離子狀態,既有利于恩諾沙星的羧基與MAA形成氫鍵,也有利于喹啉環上的胺基與MAA進行離子交換。

圖2 不同標樣稀釋液pH與ELISA方法IC50值對應曲線

2.3 直接競爭仿生ELISA方法的特征量分析

2.3.1 直接競爭仿生ELISA方法的靈敏度與檢出限 以制備的恩諾沙星印跡聚合物膜作為仿生抗體,按照上述優化條件建立直接競爭仿生ELISA,在0.1～10000 μg/L的恩諾沙星標準溶液濃度范圍內建立標準曲線。如圖3,印跡聚合物(MIP)的最高抑制率達到76%,而非印跡聚合物(NIP)的最高抑制率只有45%。方法檢出限以MIP的IC15表示為0.80 μg/L,靈敏度以MIP的IC50表示為65.93 μg/L,與王忠斌[19]合成的恩諾沙星多克隆抗體建立的直接競爭ELISA方法(IC15=0.02 μg/L;IC50=0.35 μg/L)相比,檢出限與IC50較高,但是與分子印跡聚合物應用于固相萃取進行的HPLC檢測恩諾沙星分析方法相比,有更好的檢出限與靈敏度,而且檢出限已滿足中國、歐盟、日本等國家規定的檢測標準。方法線性分析范圍為1～1000 μg/L,與多克隆抗體相比有很大提高,這是由吸附位點的異質性所決定的[21]。

圖3 恩諾沙星印跡聚合物膜與非印跡聚合物膜作為仿生抗體建立的ELISA標準曲線

這種直接競爭仿生ELISA分析方法,由于其不需要抗體包被和牛血清白蛋白的封閉過程,而節約了分析時間。綜上所述,合成MIP膜比在動物體內生成抗體更加省時經濟。因此,非常適合于大量樣品中恩諾沙星殘留的快速篩選。

2.3.2 直接競爭仿生ELISA方法的精密度 方法精密度結果分析見表1,板間變異均大于板內變異,且變異系數隨著恩諾沙星標準溶液濃度的減小而呈遞增趨勢,但是變異系數均小于20%,說明所建立的方法具有較高的精密度。

表1 直接競爭仿生ELISA 板內變異與板間變異(%)

2.3.3 直接競爭仿生ELISA方法的選擇性 由表2可知,聚合物對環丙沙星等6種氟喹諾酮類藥物幾乎均有交叉反應,而對氟甲喹、西諾沙星沒有交叉反應,由此可見,哌嗪環作為藥物結構之間的主要差別,在聚合物膜識別過程中起了較大作用。環丙沙星作為恩諾沙星在動物體內的代謝物,與恩諾沙星有十分相似的結構,更容易被特異性吸附位點識別并進入孔穴,因此交叉反應率最大。此外,由于各種喹諾酮類物質的解離常數有所不同,在溶劑中的狀態有所偏差,也會影響它們對印跡位點的吸附結合。

表2 恩諾沙星及其結構類似物的IC50值和交叉反應率(CR%)

總體來講,所建立的直接競爭仿生ELISA方法有較高的選擇性,這種選擇性源于分子印跡聚合物膜的印跡效果,識別位點的特異性取決于孔穴結構的形狀、大小,官能基團的空間排列,以及吸附溶液的種類性質,在實際應用中本方法可以進行同時檢測恩諾沙星及其代謝物環丙沙星。

2.4 樣品添加回收實驗及液相驗證

由表3可知,所建立的仿生ELISA法有較好的添加回收率,兩種樣品不同濃度的添加回收率均在90%～105%之間,其中雞肉組織樣品的添加回收率為97.30%～103.56%,豬尿樣品的添加回收率為94.48%～96.53%。所建立的仿生ELISA方法與HPLC方法對于不同ENRO添加濃度的雞肉組織樣品和豬尿樣品的回收率均值無顯著性差異(p>0.05),說明兩種方法有較好的一致性。

表3 仿生ELISA法在雞肉、豬尿樣品中恩諾沙星的添加回收率(n=3)

3 結論

本文以聚苯乙烯酶標板為載體,利用表面分子印跡技術合成恩諾沙星印跡聚合物膜,得益于表面印跡的優勢,吸附位點位于或靠近聚合物膜表面,大分子酶標探針更易于識別結合吸附位點,有利于印跡聚合物膜應用于仿生ELISA檢測方法。另外,通過對直接競爭仿生ELISA方法條件的優化,成功的建立了一種快速、準確、靈敏、經濟的方法檢測恩諾沙星。在聚苯乙烯酶標板表面直接合成的對恩諾沙星具有吸附特異性的印跡聚合物膜能夠作為仿生抗體應用于ELISA檢測實際樣品中的恩諾沙星。

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