AMDIS-SPME-GC/MS分析不同產地魚露中的揮發性物質

付 奧,趙 利,袁美蘭,劉 華,江 勇

(江西科技師范大學生命科學學院,江西南昌 330013)

魚露是以魚蝦或水產品加工的下腳料為原料,經發酵分解而成的一種調味品。不同產地的魚露因原料、發酵程度、氣候等差異而呈現出獨特而多元的氣味,深受消費者喜愛。目前對魚露的研究多集中在制備工藝[1-3]和生化特性[4-5]等方面,對魚露中揮發性物質的研究多集中在分析魚露中的某一種揮發性物質[6-7]。揮發性物質是魚露品質的重要指標,揮發性物質成分的種類、濃度、閾值和彼此間的相互作用賦予了魚露特有的香味,故對不同產地的魚露中的揮發性物質的研究就顯得十分有必要。

頂空固相微萃取技術(headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)已成功運用于多種食品[8-12]的揮發性物質的萃取。氣相色譜-質譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)與自動質譜解卷積定性系統(Automatic mass spectral deconvolution and identification system,AMDIS)、保留指數(Retention index,RI)聯用已成為復雜樣品中多組分準確定性的重要手段,應用于檢測人工麝香[13]、花椒與青椒[14]、麩炒白術[15]、花椒飲片[16]等揮發性物質的分析。

魚露基質復雜,無論如何優化色譜條件,總存在一些保留時間相近的物質,在總離子流圖上完全或部分重疊,影響質譜定性結果,而AMDIS對重疊峰、雜峰和低濃度物質有較強的解卷積能力。AMDIS對色譜峰解析后,進行NIST譜庫的自動搜索,其結果并不能確定為最終的定性結果,需要通過RI值進一步確認。RI值僅與固定相有關,當采用同一類型色譜柱時,計算RI值與參考文獻RI值誤差在±3%以內,則認為該物質定性可靠,因而將GC-MS 與AMDIS、RI結合能更準確的對揮發性物質定性。對多個樣品進行比較分析時,需要進行峰對齊。由于色譜峰數量太大,采用人工方式需要耗費大量時間。一些具有峰對齊功能的軟件被用于多樣品的色譜分析,當一些軟件進行同組但不同批號的樣品分析結果對比研究,若某種化合物僅在幾個批號樣品中被檢測到而不是全部樣品時,這種化合物可能會被丟失,也可能會被替換,這樣就會生成一份由有缺失值的分析結果。GAVIN(Assignment Validator and Integrator)則能有效地解決這一缺陷,能將多個樣品的色譜分析結果(包括積分峰面積、保留時間、名稱和凈分數等)匯總為一個數據矩陣,作為目視檢查和回填的起點數據,對比檢測每個單一樣品中的缺失值,能有效減少AMDIS軟件分析結果的缺失值[17],而且用戶可以自定義一定閾值,這個閾值可以決定了在一定百分比的樣本中找到某個揮發性物質。本實驗的閾值為50,即同一產地的某種揮發性物質只有在同一組50%以上的樣品中被檢測出才會在結果中被保留。

本文收集了廣東、泰國、越南產地的魚露和本實驗室自制的魚露,將HS-SPME-GC-MS和AMDIS、GAVIN、RI結合,對不同產地魚露中的揮發性物質進行比較,同時采用模式識別技術分析不同產地魚露的共有峰,為進一步深入研究魚露風味物質的生成機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚露 來自廣東、實驗室自制[18]、越南、泰國,見表1,分別用gd、yl、yn、tg1、tg2表示,每種魚露各有6個不同批號,均在保質期內;NaCl(分析純) 上海綠源精細化工廠;C 5～C 44正構烷烴混合對照品 美國Restek公司。

表1 5種魚露樣品信息

QP2010型氣相色譜-質譜聯用儀 日本島津公司;Rtx-5 MS 30 mm×0.25 mm i. d.×0.10 μm石英毛細柱 美國Restek公司;AOC-5000型頂空-固相微萃取三合一自動進樣器 瑞士CTC公司;85 μm聚丙烯酸酯(polyacrylate,PA)萃取頭 美國Supelco公司;20 mL頂空瓶 美國Alltech公司;20 mm含PTFE/藍色硅膠蓋墊磁性蓋 德國CNW Technologles Gmbh。

1.2 實驗方法

根據前期實驗的優化條件[7],移取5 mL魚露樣品于20 mL頂空瓶,加入5 g NaCl后,置于自動進樣器中,在優化的條件即萃取溫度50 ℃、萃取時間40 min和振蕩頻率500 r/min的條件下進行HS-SPME,之后將萃取頭在氣相色譜的進樣口解吸5 min,進行GC-MS分析。每組樣品分別測6次不同批號的樣品。

1.2.1 色譜條件 載氣:He(99.999%);柱前壓:50.4 kPa;進樣溫度:250 ℃;程序升溫:40 ℃保持2 min,以5 ℃/min升至150 ℃,20 ℃/min升至300 ℃并保持4 min。

1.2.2 質譜條件 離子化方式為電子轟擊(electron impact ionization,EI),離子源溫度:230 ℃,接口溫度:260 ℃,初始狀態為不分流進樣,2 min后打開分流閥,分流比例20∶1;溶劑延遲:2.5 min;監測方式為全掃描方式,掃描范圍:50～350 m/z。

1.3 數據分析

GAVIN結合AMDIS被用于不同魚露的揮發性的鑒定。所獲總離子流圖(Total ion chromatogram,TIC)的色譜峰,以CDF格式保存,并經AMDIS進行自動解卷積處理和NIST譜庫檢索,要求正逆匹配度在700以上,在NIST網站(http://webbook. nist. gov/chemistry/name-ser. html)中搜索文獻，結合文獻檢索對比該化合物的相對保留指數(RI),當計算RI值與參考文獻RI值誤差在±3%以內,則認為該物質定性可靠。所有TIC經AMDIS處理后產生CDF文件;萃取溶劑、平行測定等信息的元數據;GC-MS數據經AMDIS處理后產生包含樣品揮發性物質峰面積,保留時間、名稱等信息的FIN和FIN文件中數據經提前后與數據庫中的離子匹配的結果數據;將它們導入Matlab,經GAVIN進行峰對齊,并自動形成數據矩陣,其每一行為所有樣品同一成分的峰面積,每一列為不同樣品。以上4組數據匯總的數據矩陣作為起點數據,會回填每個產地不同批號魚露樣品中的缺失值,最后GAVIN從這些數據中提取出樣品中揮發性物質的標準質圖譜、保留時間、定量離子及平行樣品中的檢查的所有揮發性物質的數量等信息,最終生成一個結果數據矩陣來用于AMDIS的揮發性物質結果鑒定。5種魚露中的共有揮發性物質進行PCA(Principal Component Analysis,PCA)分析,以區分不同產地魚露。GAVIN和PCA均為在Matlab 7.0版本上編寫的腳本。

2 結果與分析

2.1 揮發物定性和峰對齊

圖1為不同產地魚露的總離子流圖,由圖可知gd魚露樣品出峰時間主要集中在20～30 min,tg1和tg2魚露樣品的出峰時間主要集中在0～13 min和20～30 min,yl魚露樣品的出峰時間主要分布在5～33 min,yn魚露樣品的出峰時間分布在3～30 min,五種魚露樣品的TIC圖在響應豐度上有著直觀差異,這是由于不同魚露樣品中揮發性化合物及其濃度不同而導致。但由圖可看出在3、13、27 min附近,五種魚露均有出峰,這表明不同產地魚露樣品間存在著共有揮發性物質。

圖1 五種魚露樣品中揮發性物質的總離子圖

所有魚露樣品經過Volker[17]在Matlab平臺上編寫GAVIN腳本,將多個AMDIS 文件的結果合并,自動進行峰對齊,產生一個供多元統計分析的數據矩陣。

2.2 揮發性物質

5種魚露樣品檢測的揮發性物質經AMDIS和GAVIN處理后,在NIST普庫中一共確定93種揮發性物質,結果見表2。其中硫醚類物質1種,酸類物質12種,醛類物質3種,醇類物質13種,硫類物質1種,醚類物質1種,酮類物質9種,烴類物質10種,酯類物質12種,雜環類物質6種,芳香類物質25種。

表2 HS-SPME-GC-MS法測定5種魚露中揮發性成分

續表

在yl魚露樣品中鑒定出53種揮發性物質,其中相對百分含量較高的是醋酸(13.06%)和2-呋喃甲醇(5.87%),其他一些代表性揮發物分別是丁酸(0.26%)和丁烯酮(0.18%),一些僅在yl中鑒定出來的揮發性物質分別是乙基異丙基硫醚、二十烷、呋喃、十五醇、吡啶、丙位癸內酯、十四酸乙酯、十七烷酸乙酯、鄰甲酚、四氫萘酚、丙氧基苯、對甲氧基苯。yn、tg1和tg2魚露樣品分別鑒定出了51、47和45中揮發性物質。

yn魚露樣品中主要揮發性物質是2,4-二叔丁基苯酚(22.72%)和十四烷酸(12.68%),其他代表性揮發性物質是庚酸(4.92%)和2-十一酮(0.10%),僅在yn樣品中鑒定出的揮發性物質是3-甲基戊酸、氫化肉桂酸、正癸酸、異十九烷、三甲基吡嗪、2-乙基-3-(鉀硫基)吡嗪、己酸異戊酯、3.5-二甲基苯酚、愈創木酚、對甲氧基苯酚、丁香酚。

來自同一品牌的tg1和tg2魚露樣品中的揮發性物質種類相似,其中相對百分含量較高的物質是2,4-二叔丁基苯酚(56.71%)和苯酚(15.95%),tg樣品中獨有揮發性物質有4種,其中3-甲基十二烷、苯丙酮在tg1樣品中被鑒定出,N-(3-氯-2-氟苯甲酰)-丙氨酸戊酯、1-苯基萘在tg2中被鑒定出。

五種魚露樣品中,gd魚露樣品中鑒定出的揮發性物質最少,44種。其中揮發性物質相對含量較高的物質是2,4-二叔丁基苯酚(44.75%)和苯酚(31.82%),其他一些代表物質分別是4-甲基苯酚(0.03%)和1-萘酚(0.01%),僅在gd樣品中檢測出的揮發性物質是苯乙烯、2-莰醇、1-甲基-4-(1-甲基乙基)環己醇、2,2-二甲基-3-(3-甲基苯基)丙醇、2,2-二苯基乙醇、1-苯基-2-丙酮、5-甲基-2-乙?；秽?,2-二甲基萘。

魚露樣品中的獨有組分均未見報告,表明AMDIS能通過解卷積來拆解來重疊峰和低濃度物質,為揮發性物質的定性提供幫助。魚露中的一些揮發性前體物質是由氨基酸或者脂肪酸在酶或微生物的影響下和降解過程中共形成的,但由于生產魚露的原料魚類,發酵的微生物種類以及酶解途徑等因素對魚露中特征揮發性物質的形成有很大影響,所以現代規?；a的魚露存在風味異變的問題[19]。

gd魚露樣品中酯類和芳香類揮發性物質相對百分比含量比其他產地魚露樣品中含量高,分別為9.64%和76.8%。酯類揮發性物質是魚露在發酵過程中脂質代謝產物而生成的醇和羧酸的酯化作用而形成[20],多呈果香和花香味,且閾值較低,,能賦予魚露甜香、水果香、花香[21-22]。不同產地魚露中的主要酯類揮發性物質是酞酸二甲酯和1,2-苯二甲酸二丁酯,其最高相對百分比含量分別在gd和yn魚露樣品中檢測出,是4.39%和6.33%。芳香類揮發性物質形成原因較為復雜,但此類揮發性物質閾值較低,是食品的特征風味的重要組成,如愈創木酚具有煙味和甜味;吲哚類物質呈花香味[23]。不同產地魚露中主要芳香類揮發性物質是苯酚、和2,4-二叔丁基苯酚,其最高相對百分比含量分別在gd和tg1魚露樣品中檢測出,分別是31.82%和56.71%。

tg魚露樣品中酮類揮發性物質相對百分比含量比其他產地魚露樣品中含量高,tg1和tg2魚露樣品分別為2.41%和2.37%。酮類揮發性物質與多不飽和脂肪酸的熱氧化或降解、氨基酸降解等有關[24],具有花香和果香味,且閾值高,對食品的整體甜的花香和果香風味有增強作用[25]。不同產地魚露樣品中的主要酮類揮發性物質是乙位紫羅蘭酮和二苯甲酮,其最高相對百分比含量分別在gd和tg2魚露樣品中檢測出,是0.80%和1.22%。苯乙酮在5種魚露樣品中均被檢測出,與徐偉[26]檢測結果一致。

yn魚露樣品中酸類和雜環類揮發性物質相對百分比含量比其他產地魚露樣品中含量高,分別是41.75%和5.45%。酸類揮發性物質是由脂肪的水解以及脂肪氧化過程中產生[27],大多帶有腐敗、汗味或令人作嘔的不愉快氣味,閾值較高,對魚露整體風味有不良影響。不同產地魚露樣品中主要酸類揮發性物質是醋酸、十四烷酸,其最高相對百分比含量分別在yl和yn魚露樣品中檢測出,是13.06%和12.68%。此外與徐偉等[26]和江津津等[28]報道結果一致,辛酸、丙酸、丁酸、戊酸也在魚露樣品中被檢測出。雜環類揮發性物質形成原因較為復雜,但此類揮發性物質閾值較低,是食品的特征風味的重要組成,如吡嗪雜環,是脂肪氧化物參與美拉德反應的結果產物,具有堅果香味和烤香味[29],是蝦醬類食品的特征物質[30]。2-乙基-6-甲基吡嗪與2,6-二甲基吡嗪與其他學者在魚醬油中檢測結果一致[26,28]。

yl魚露樣品中烴類、醛類和醇類揮發性物質相對百分比含量比其他產地魚露樣品中含量高,分別是7.99%、3.36%和14.44%。烴類揮發性物質是脂肪酸氧化自由基的均裂所致[31],大多帶清香和香甜味,閾值和含量均較低,對魚露的風味貢獻不大[32]。不同產地魚露樣品中主要烴類揮發性物質是十七烷和二十烷,其最高相對百分比含量在yl魚露樣品中檢測出,是5.38%和2.12%。醛類揮發性物質是多不飽和脂肪酸在微生物和酶的作用下氧化降解產生[33],與魚露發酵過程中的酵母代謝產物有關,會產生令人愉悅的氣味閾值低,對食品的整體風味有重要影響[34]。不同產地魚露樣品中主要烴類揮發性物質是苯甲醛和苯乙醛,其最高相對百分比含量分別在gd和yl魚露樣品中檢測出,是1.05%和1.93%。醇類揮發性物質是脂肪酸二級氫過氧化物的分解、脂質氧化酶對脂肪酸的作用、脂肪的氧化分解生成,或由羰基化合物還原生成醇[24],大多呈香甜的果香,但閾值分布范圍較大。不同產地魚露樣品中主要醇類揮發性物質是2-呋喃甲醇和苯乙醇,其最高相對百分比含量在yl魚露樣品中檢測出,是5.87%和4.17%。檢測結果與徐偉等[26]在低鹽魚醬油中的檢測結果一致。

2.3 主成分分析

5種魚露樣品的共有揮發性物中發現共有組分的相對含量都相對較低,大部分低于1%,除了gd、tg1、tg2樣品中的苯酚含量較高,相對百分比大于10%。這說明不同產地魚露的揮發性物質在揮發性物質上具有一定的相似性,但揮發性物質的含量具有較大的差異性。為研究不同產地魚露中共有物質對魚露產地區分的貢獻程度,對11種共有物質的峰面積進行PCA分析,由表3可知,五種魚露的11種共有物質能很好的區分不同產地的魚露,其中PCA1的貢獻率是73.29%,PCA2的貢獻率是22.41%,兩者累計貢獻率達到了95.70%,表明魚露中的共有化學物質是區分不同產地魚露樣品的主要成分。不同產地魚露在圖2中數據分散無重疊,表明雖然是魚露的共有組分,但不同產地的魚露樣品揮發性物質經過PCA降維后有明顯區別。11種共有組分做載荷分析,其中3、4、6、10號物質即苯酚、2-乙基己醇、苯乙醇、α-氯乙酰苯,4種化合物對不同魚露樣品的區分貢獻較大。貢獻率越大表明它們在不同樣品魚露中的差異越大,形成這些揮發性的前體物質大多都是非揮發性物質,如脂肪、氨基酸和短肽等,這些前體物質差異性可能與生產魚露的原料有關,也可能與發酵的鹽濃度和發酵菌種有關[35-36]。

表3 5種魚露樣品共有物質PCA圖的主成成分貢獻率

圖2 5種魚露樣品共有物質的PCA分析圖

3 結論

本文通過HS-SPME-GC-MS分析了不同產地魚露中的揮發性物質,TIC圖譜經AMDIS解卷積處理,并經RI值對比確認后,最終定性了93種揮發性物質,硫醚類物質1種,酸類物質12種,醛類物質4種,醇類物質13種,硫類物質1種,醚類物質1種,酮類物質9種,烴類物質10種,酯類物質12種,雜環類物質5種,芳香類物質25種。且不同產地魚露揮發性物質差異較大,其中廣東魚露樣品中酯類和芳香類揮發性物質的相對含量高,泰國魚露樣品中酮類揮發性物質的相對含量高,越南魚露樣品中酸類和雜環類揮發性物質的相對含量高,實驗室自制魚露樣品中烴類、醛類和醇類揮發性物質相對含量高。將GAVIN與AMDIS結合分析魚露樣品的TIC圖譜,能夠自動進行平行樣品色譜圖的的峰對齊,五種魚露中的獨有組分有35種,共有組分有11種。5種魚露樣品中的11種共有揮發性物質的PCA和載荷分析表明,其共有揮發性組分在魚露樣品中的差異性較大,對區分不同產地的魚露有不同程度的貢獻,能較好的區分不同魚露產地。本論文的研究的結果,為不同產地魚露的鑒別提供了分析方法,其分析手段也可用于其他多樣品TIC的比較分析。

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