肉制品中牛源性成分Taqman熒光定量PCR檢測法的建立

李 亮,趙 新,劉 娜,尚宏麗,*,王 永,蘭青闊,柏 韻,王 寧

(1.錦州醫科大學,遼寧錦州 121000;2.天津市農業質量標準與檢測技術研究所,天津300381)

牛肉可以為人體補充多種元素及維生素,且葉酸含量高于普通肉類[1]。近年來,在牛肉中摻假的情況屢見不鮮。一般都是以豬肉、雞肉、鴨肉為原料,經牛油浸泡和添加香精等方法處理后混進牛肉再進行售賣[2]。在牛肉中摻假降低了食品行業信譽度并干擾了肉制品的良性競爭關系[3]。

目前,已經有許多技術被應用于肉制品摻假檢測。冼鈺茵等[4]以具有高度保守性的線粒體細胞色素B基因為靶基因,建立了牛源性成分快速檢測的LAMP檢測方法。郭燕華等[5]應用重組酶聚合酶等溫擴增技術,建立基于重組酶介導的等溫擴增技術檢測方法。苗麗等[6]基于數字PCR技術,建立了定量檢測肉及肉制品中牛肉和豬肉含量的方法。與此同時實時熒光PCR技術也是被廣泛應用于動物源性成分的檢測[7],其時效性與準確性方面的優勢使得該技術已經逐步取代了普通PCR技術和其他鑒定技術。但是熒光定量PCR技術要達到動物源性成分定量檢測的目的,必須減少樣品與標準品間的偏差。引入合適的內參基因可以減少偏差并減少實驗誤差,由此可達到定量檢測的目的并有效提高了方法的準確性及可信性[8-9]。

本實驗采用Taqman實時熒光PCR相對定量法,鑒別肉制品中牛源性成分,鑒于熟肉及加工制品的DNA穩定性可能受到一定程度的破壞,根據牛肉中高度保守性的線粒體細胞色素b基因組編碼序列的差異設計熒光定量特異性PCR引物和探針,并基于線粒體DNA,篩選肉源成分共同具備的一段高度保守序列區間確定內參基因,以期達到對肉制品中牛源性成分的定量檢測,為量化肉制品摻假研究提供借鑒并為保護消費者權益提供有效參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛肉、雞肉、鴨肉、豬肉、羊肉、驢肉、鯽魚、大豆粉等 均購于天津市農貿市場;含牛肉成分的肉制品,如手撕風干牛肉、麻辣牛肉絲、牛肉絲、牛肉紅腸、午餐肉等 均購于天津各大型超市及農貿市場;DNA提取主要試劑:NaOH、NaCl 天津市風船化學試劑科技有限公司;Tris、EDTA、十二烷基磺酸鈉 美國sigma公司;異丙醇、乙醇 天津虔誠偉業科技發展有限公司;TE緩沖液、蛋白酶K、RNA酶 上海生工生物技術有限公司。SuperMix-UDG預混液 Invitrogen公司;引物、探針 由上海生工生物技術有限公司合成。

CFX96Touch型熒光定量PCR儀、ND-1000型核酸蛋白測定儀 美國伯樂Bio-Rad;Allegra 21R Centrifuge高速冷凍離心機 美國BECKMAN公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物與探針的設計 根據GenBank上牛、羊、豬、雞、鴨、馬、驢、鼠、狗等的16SrDNA基因的序列,合成通用引物。同時參考文獻[7]并根據GenBank中公布的牛線粒體DNA細胞色素b基因序列,運用Primer Express 3.0軟件,設計引物和探針序列,見表1。

表1 PCR和測序引物序列

1.2.2 樣品的制備 先剔除待測的牛肉和雞肉中的結締組織和脂肪,然后將不同比例的牛肉與雞肉混合,其中牛肉的質量百分數為20%、40%、60%、80%、100%,以100%的牛肉所提取出的DNA作為標準品繪制標準曲線。將牛肉與雞肉分別置于絞肉機中充分絞碎,在60 ℃烘干箱中烘干呈肉粉狀。

1.2.3 DNA模板的提取 參考文獻[10]并稍作調整。稱取100 mg樣品于2 mL無菌離心管中,加入600 μL SDS裂解液[11](10 mol/L NaOH、500 mmol/L EDTA、1 mol/L Tris·Cl、5 mol/L NaCl、10%十二烷基磺酸鈉)和20 μL蛋白酶K。65 ℃水浴消化1 h,每隔10 min混勻振蕩一次,直至澄清透明(如1 h無法使溶液透明可適當延長水浴時間)。加入10 μL RNA酶,65 ℃消化10 min。13200 r/min離心5 min,取上清液并與0.8倍異丙醇混勻后加到吸附柱中。13200 r/min離心2 min,倒掉廢液后向吸附柱中加入500 μL乙醇[12]。13200 r/min離心2 min,倒掉廢液,重復上述步驟三次。于室溫放置,使乙醇完全揮發后將吸附柱轉移到一個新的離心管中。加入100 μL TE緩沖液,13200 r/min離心2 min,既得DNA溶液。

1.2.4 牛源性成分實時熒光PCR反應條件的建立 PCR反應體系為20 μL,各成分含量為:2×SuperMix-UDG預混液10 μL,探針引物0.4 μL,上下游引物各1 μL,模板2 μL(50 ng/μL)無菌超純水補足20 μL。循環程序為:95 ℃ 30 s,60 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s[13],45個循環。

1.2.5 核酸溶液純度及濃度測定 將0.1 g不同肉源品種及樣品進行DNA提取,并用100 μL的TE緩沖液溶解,在核酸蛋白測定儀中進行核酸含量及核酸溶液純度的測定[14]。

1.2.6 標準曲線的繪制 兩條標準曲線分別以表1所示的Rd1和16S rDNA為引物,配制5個梯度濃度牛肉標準品(100、50、10、5、1)作為模版,每個梯度三個平行,根據1.2.4所述反應條件進行反應。

1.2.7 方法特異性研究 利用本方法對羊肉、豬肉、鴨肉、雞肉、驢肉、鯽魚、大豆粉的DNA進行檢測,以已知牛肉DNA作為陽性對照,去離子水作為陰性對照[15]。

1.2.8 方法靈敏度研究 利用超純無菌水將100%牛源性成分的DNA樣本進行系列梯度稀釋,獲得50 ng/μL、10 ng/μL、5 ng/μL、1 ng/μL、500 pg/μL、100 pg/μL、50 pg/μL、10 pg/μL、5 pg/μL、1 pg/μL濃度的DNA,進行實時熒光PCR檢測以觀察本方法的靈敏度。

1.2.9 樣品檢測 按照上述的方法對將不同比例的牛肉與雞肉混合肉粉(其中牛肉的質量百分數為20%、40%、60%、80%、100%)進行加標回收實驗及肉制品中提取的DNA進行檢測。每個樣品設置兩個平行。

1.3 數據處理

采用Bio-Rad CFX Manger 3.1進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 DNA模版純度及濃度測定

核酸提取過程中容易混入蛋白質及碳水化合物等雜質。其中A260/A280>1.8可以說明溶液中無蛋白質污染,A260/A230比值可以幫助判斷核酸溶液中是否混有糖類等雜質,當A260/A230<2.0時,則說明DNA溶液被碳水化合物污染[16]。由表2可知,本實驗用于特異性研究的不同肉源品種DNA溶液、用于加標回收實驗的混合肉粉提取的DNA溶液及檢測樣品中提取出的DNA溶液均較好的去除了蛋白質及碳水化合物等雜質。

表2 不同肉源品種DNA濃度

2.2 標準曲線的建立

應用熒光定量PCR儀自帶軟件,標準品的Cq值(是指每個反應管內的熒光信號到達設定域值時所經歷的循環數)與初始濃度的對數值呈線性關系,可得圖1。既得牛特異性基因的標準曲線y=-3.4046x+29.708,R2=0.994,擴增效率E=96.6%。內參16S rDNA的標準曲線y=-3.4074x+21.250,R2=0.998,擴增效率E=96.6%。并通過公式(1)～公式(3)來計算樣品中牛肉的含量[17]。

圖1 定量標準曲線

cDNA(meatbeef)=10[(Cqbeef-dbeef)/slopebeef]

式(1)

cDNA(meattotal)=10[(Cq16s-d16s)/slope16s]

式(2)

式(3)

其中:cDNA(meatbeef)是樣品中牛肉DNA的濃度(ng/μL),cDNA(meattotal)是樣品中總肉類的DNA濃度(ng/μL)。Cqbeef是樣品以牛特異性引物Rd1為引物時的Cq值,Cq16s是樣品以16S為引物時的Cq值。dbeef和d16s分別為兩種引物標曲的截距,slopebeef和slope16s分別為兩種引物標曲的斜率。

2.3 引物和探針的特異性實驗及通用性實驗

通過對牛肉、羊肉、豬肉、鴨肉、雞肉、熟驢肉、鯽魚、大豆粉檢測,其結果如圖2所示。結果表明,此引物和探針只針對牛肉可以進行特異性擴增,對羊肉、豬肉、鴨肉、雞肉、熟驢肉、鯽魚、大豆粉的DNA均不能擴增。

圖2 方法特異性研究熒光擴增曲線

2.4 靈敏度

如圖3所示,以50 ng/μL～1 pg/μL的牛源性成分DNA樣本作為模板時,均能收集到明顯的熒光擴增曲線,而以5、1 pg/μL的牛源性成分DNA樣本和去離子水作為模板時,熒光擴增為陰性,因此本方法的最低檢出限為10 pg/μL DNA濃度。

圖3 方法靈敏度研究熒光擴增曲線

2.5 回收實驗

按方法1.2.4,采用本實驗所建立的實時定量PCR方法對不同質量比例牛肉與雞肉混合肉粉的DNA樣品進行回收率實驗,以驗證方法準確性。檢測結果如表3所示,并根據公式(1)(2)(3)計算得出混合肉粉中牛肉的含量。對比理論混合百分比可知平均回收率為98.62%,說明該方法與真實值較為接近,具有較好的準確性。

表3 混合肉樣中牛肉含量的定量檢測

2.6 市售樣品檢測結果

本實驗選用采購自各大型超市及農貿市場含牛肉成分的肉制品如:手撕風干牛肉、麻辣牛肉絲、牛肉絲、牛肉紅腸、火腿腸等,進行方法適用性驗證。利用本方法對肉制品進行檢測,每種樣品設置兩個平行。并通過對市售樣品檢測可知,從樣品處理到熒光定量PCR完成大約需要4～5 h。說明本方法所需時間較少,檢測效率較高。結果如表4所示。

表4 市售樣品檢測結果

3 討論

隨著消費者消費水平的日益提高,誠信度也成為消費者選擇肉制品的一個重要因素。目前研究肉制品中異源基因的技術有很多。Calvo 等[18]開發并評估了一種用于檢測豬肉、雞肉、鴨肉、火雞肉和鵝肉的 PCR-RAPD 技術,檢測靈敏度達到 250 pg。雖然PCR-RAPD技術是一種很好的檢測肉類摻假手段,但是該技術重復性較差且結果分析復雜[19]。微滴式數字PCR可以對樣品進行絕對定量,但是檢測通量較低,對實驗操作人員的專業要求較高,這大大增加了其在檢測方面應用的困難。實時熒光定量PCR由于添加了Taqman探針和熒光信號,使得其特異性及敏感性高于常規PCR,并且Real-time PCR在實時檢測過程中是處于封閉的體系中進行擴增,降低了電泳過程中PCR產物的污染的可能,有效的減少了檢測時間,特別是在檢測大批量樣品時其優勢尤為突出[20]。較數字PCR相比檢測成本也大大降低。

目前,有研究表明在動物體內的不同組織內線粒體DNA的數量也不盡相同[21],因此本方法目前只能應用于肉制品而不能應用與參雜動物組織器官的樣品。由于在肉制品加工過程中會破壞待測樣本DNA,造成DNA片段長度的銳減[22],因此待測基因片段過長會導致在擴增過程中無法檢測到目的片段。而本實驗采用的牛線粒體DNA細胞色素b基因作為靶基因,根據其差異性設計引物及探針,使得檢測片段長度僅為95 bp。

4 結論

實驗結果表明,此方法對牛肉特異性較好,對羊肉、豬肉、鴨肉、雞肉、熟驢肉、鯽魚、大豆粉均無特異性擴增。此外,對于樣品檢測也具有較高的效率,按每個樣品兩個平行計算,一次最多可進行48個樣品的檢測。靈敏度方面也達到了10pg/μL。因此,本實驗所建立的Taqman實時熒光定量PCR檢測肉制品中牛源性成分的方法具有較高的準確性及可行性,對于肉制品中牛源性成分的檢測及對肉制品成分的監督具有一定的實際意義。

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