水解工藝對苦蕎提取物中槲皮素含量的影響及其藥代動力學研究

鄭 瑾,卓虹伊,宋 雨,代麗萍,鄧園源,鄒 亮2,,陳慧娟

(1.成都大學四川抗菌素工業研究所,四川成都 610052;2.成都大學醫學院,四川成都 610106;3.成都大學農業部雜糧加工重點實驗室,四川成都 610106;4.成都中醫藥大學藥學院，四川成都 611137;5.成都大學藥學與生物工程學院,四川成都 610106;6.四川省中醫藥科學院中醫研究所,四川成都 610031)

苦蕎為蓼科蕎麥屬雙子葉植物苦蕎麥(Fagopyrumtataricum(L.)Gaertn)的干燥成熟種子,又名韃靼蕎麥、萬年蕎。它是一種藥食同源雜糧,不僅含有蛋白質、維生素、微量元素等豐富的營養成分[1-3],還富含蘆丁、槲皮素(兩者互為苷和苷元,蘆丁在體內外可轉化為槲皮素)等黃酮類生物活性成分,其中蘆丁含量最高,約占總黃酮的85%[4]。現代藥理研究表明蘆丁和槲皮素均具有降血糖、抗氧化、抗菌、抗腫瘤等作用[5-6]。

由于其獨特的生物活性,近年來苦蕎新產品開發已成為苦蕎現代加工新型產業,苦蕎掛面、茶飲、面點、酒、芽菜等多種形式的產品已走向市場。但其主要活性物質蘆丁在腸道菌群作用下會轉化為槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素、蘆丁去羥基化產物以及甲基化產物等代謝產物[7]。在葡萄糖存在的情況下腸道細菌還可將蘆丁、槲皮素-3-O-葡萄糖苷代謝為3,4-二羥基苯乙酸、蟻酸鹽、丁酸鹽等[8],這導致蘆丁在體內難吸收,血藥濃度低,口服生物利用度差,難以較好的發揮生物活性,而槲皮素較蘆丁脂溶性強更易于跨膜吸收進入血液循環更好的發揮生物活性。為了提高苦蕎加工產品中蘆丁和槲皮素在機體內吸收的相對量,指導深加工工藝,本文采用藥代動力學方法(藥物代謝動力學簡稱藥動學,主要研究機體對藥物的處置的動態變化。包括藥物在機體內的吸收、分布、代謝及排泄的過程,特別是血藥濃度隨時間變化的規律)進行深入研究。

藥動學研究表明,自然界中多數糖苷類化合物是在腸道菌群作用下酶解為苷元發揮藥效,且機體對苷類化合物的吸收小于其苷元類化合物[9],如芍藥苷的生物利用度比其苷元低40倍[10]。同時,由于胃的特殊酸性環境,其能快速吸收槲皮素而不能水解吸收其苷類成分蘆丁[11]。

故本研究通過前處理工藝,利用鹽酸對苦蕎提取物中的蘆丁進行酸水解以提高槲皮素含量,即改變苦蕎提取物組成。再進一步結合藥代動力學方法,探討酸水解對苦蕎提取物中蘆丁和槲皮素進入機體血液循環相對量的影響,為其他富含蘆丁的天然產物的深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Wistar雄性大鼠 30只、210±10 g、SPF級,動物許可證號SCXK(川)2015-030,四川達碩生物科技有限公司;苦蕎籽 四川金堂西蕎1號種子;蘆丁標準品(批號140225,純度≥98%)、槲皮素標準品(批號150419,純度≥98%)、黃芩素標準品(批號160725,純度≥98%) 四川省維克奇生物科技有限公司;β-葡萄糖醛酸酶(SL-BG93V,90000 units/mL)、硫酸酯酶(SLBM7635V,10000 U/mL) 美國Sigma公司;乙醇、鹽酸、羧甲基纖維素鈉等 均為分析純;乙腈、甲醇、冰醋酸 色譜純;肝素化1.5 mL離心管(2 mg/mL肝素鈉溶液50 μL烘干) 實驗室自制。

CPA225D型電子天平 德國賽多利斯公司;HH-4型數顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司;KH5200DE型數控超聲波機 昆山禾創超聲儀器有限公司;WH-3型渦旋混合儀 上海滬西分析儀器有限公司;高效液相色譜儀(LC-20AB型二元泵、SPD-20A型紫外檢測器、SIL-20A型自動進樣器) 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 苦蕎提取物酸水解

1.2.1.1 苦蕎提取物及其供試品溶液的制備 稱取苦蕎籽適量,用60%乙醇85 ℃回流提取2次、每次2 h,過濾、合并濾液,80 ℃減壓干燥[12]即得苦蕎提取物。稱取苦蕎提取物10 mg于10 mL棕色容量瓶中,甲醇超聲溶解并定容至刻度,用0.22 μm濾膜過濾,即得,備用。

1.2.1.2 苦蕎提取物中蘆丁、槲皮素含量測定色譜條件 色譜柱:Global Chromatography C18(250 mm×4.6 mm、5 μm);柱溫35 ℃、檢測波長275 nm、流動相0.2%醋酸水(A)-乙腈(B)梯度洗脫(0.01～10 min,25% B;10～13 min,75% B;13～20 min,25% B)、流速1.0 mL/min、進樣量20 μL。

1.2.1.3 苦蕎提取物酸水解 稱取苦蕎提取物1 g,置于圓底燒瓶,加入適量一定濃度的乙醇溶液25 mL(含VC2 mg/mL)超聲溶解,再加入濃鹽酸適量、混勻,并用該乙醇溶液補足反應溶劑至30 mL。將圓底燒瓶置于水浴鍋中加熱回流,冷卻過濾,水洗濾餅至中性,70 ℃減壓干燥,避光保存。

1.2.1.4 單因素實驗 參照“1.2.1.3”項下方法,酸水解條件為:固定反應條件為乙醇百分含量90%、水解溫度50 ℃、水解時間2 h,考察不同的鹽酸百分含量(0.14%、0.28%、0.42%、0.56%、0.71%、0.83%、0.98%、1.12%)對槲皮素含量變化的影響;固定反應條件為鹽酸百分含量0.83%、乙醇百分含量90%、水解溫度50 ℃,考察不同水解時間(0.5、1、1.5、2、4、6、8、10 h)對槲皮素含量變化的影響;固定反應條件為鹽酸百分含量0.83%、水解溫度50 ℃、水解時間6 h,考察不同乙醇百分含量(40%、60%、80%、90%、100%)對槲皮素含量變化的影響;固定反應條件為鹽酸百分含量0.83%、水解時間6 h、乙醇百分含量60%,考察不同水解溫度(30、50、70、90 ℃)對槲皮素含量變化的影響。進行單因素實驗,考察各因素變量對苦蕎提取物酸水解后槲皮素含量變化的影響。

1.2.1.5 苦蕎提取物酸水解正交實驗 為優化苦蕎提取物中蘆丁酸水解為槲皮素的工藝,以槲皮素的含量為指標在單因素考察的基礎上設計四因素三水平的正交實驗見表1。

表1 L9(34)正交實驗因素水平表

1.2.1.6 苦蕎提取物酸水解樣品制備 根據正交實驗最佳酸水解工藝,在苦蕎提取物酸水解過程中第1、2、4、6 h分別取樣,并醇沉去糖、取濾液回收乙醇,然后水沉蘆丁與槲皮素、冷卻過濾、水洗濾餅至中性,70 ℃減壓干燥。即得不同槲皮素含量的酸水解產物1、2、3、4,用于后續藥代動力學實驗。

1.2.2 苦蕎提取物酸水解產物藥代動力學

1.2.2.1 槲皮素儲備液、黃芩素內標液配制 精密稱取槲皮素對照品10.28 mg,用甲醇配制成質量濃度為1028 μg/mL的槲皮素儲備溶液。精密稱取黃芩素對照品12.12 mg,配制成質量濃度為1212 μg/mL的黃芩素儲備液,并稀釋成質量濃度為80.8 μg/mL的黃芩素內標液。

1.2.2.2 給藥與樣本采集 30只Wistar雄性大鼠隨機分為5組、每組6只,分別為苦蕎提取物組、水解產物1、2、3、4組。實驗前16 h大鼠禁食不禁水,灌胃給予苦蕎提取物及各水解產物200 mg/kg,分別于灌胃前及灌胃后5、10、20、30、60、120、240、360、480、720、960、1200、1440 min經尾靜脈取血約0.3 mL置于1.5 mL肝素化的離心管中,室溫4000 r/min離心10 min,取上清液備用。

1.2.2.3 血漿樣品處理方法 參照文獻[13]血漿樣品處理方法,取血漿100 μL加入0.5 mol/L乙酸溶液(含VC2 mg/mL)20 μL,加入β-醛酸酶和硫酸酯酶混合溶液100 μL(含β-醛酸酶和硫酸酯酶各100 IU)混勻,37 ℃孵化30 min,再加入80.8 μg/mL的黃芩素內標溶液15 μL,混勻后加入乙酸乙酯1 mL、2000 r/min渦旋2 min、5000 r/min離心5 min,吸取上清液,37 ℃氮氣吹干,殘渣以100 μL甲醇復溶、12000 r/min離心5 min,吸取上清液測定槲皮素和黃芩素的峰面積,并計算其比值,代入標準曲線計算槲皮素含量。

1.2.2.4 大鼠血漿槲皮素含量測定 色譜條件同“1.2.1.2 苦蕎提取物中蘆丁、槲皮素含量測定色譜條件”。

1.2.2.5 方法學 專屬性考察：取槲皮素、黃芩素儲備液少許以及“1.2.2.2”項下的空白血漿及灌胃后含藥血漿,經“1.2.2.3”項下血漿樣品處理,按照“1.2.1.2”項下的色譜條件進行測定。

線性關系考察:取槲皮素儲備溶液,并用甲醇逐級稀釋為質量濃度為25.700、5.140、1.028、0.206、0.103、0.051、0.028 μg/mL的系列槲皮素標準溶液。取上述標準溶液各100 μL,分別加入“1.2.2.2”項下空白血漿100 μL,經“1.2.2.3”項下血漿樣品處理方法處理,按照“1.2.1.2”項下的色譜條件進行測定,并計算槲皮素與黃芩素峰面積的比值。

精密度與準確度:制備低、中、高3個不同濃度的槲皮素對照品溶液100 μL、各5份,分別加入“1.2.2.2”項下空白血漿100 μL,經“1.2.2.3”項下血漿樣品處理方法處理制成濃度為0.066、12.850、24.015 μg/mL的質控樣品,按照“1.2.1.2”項下的色譜條件進行測定,計算日內精密度;連續測定3 d,每天1次,計算日間精密度;各質控樣品的實測濃度與相應質量濃度槲皮素對照品溶液的比值即為準確度。

提取回收率:制備上述低、中、高3個不同濃度質控樣品,各5份,按照“1.2.1.2”項下的色譜條件進行測定,與相應質量濃度槲皮素對照品溶液的峰面積進行比較,計算回收率(%)。

穩定性考察:制備上述低、中、高3個不同濃度的血漿樣品,分別在室溫條件下放置6 h、-20 ℃凍存7 d,冷凍凍融1次,經“1.2.2.3”項下血漿樣品處理方法處理,以及上述低、中、高3個不同濃度的質控樣品在4 ℃條件下放置24 h后,按照“1.2.1.2”項下的色譜條件進行測定,測定血漿樣品中槲皮素的質量濃度,考察其穩定性。

1.3 數據處理

血藥濃度數據采用DAS 2.0軟件進行藥代動力學參數計算,并結合SPSS 19.0進行方差分析,比較各實驗組的藥代動力學參數是否有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 苦蕎提取物酸水解

2.1.1 苦蕎提取物中蘆丁、槲皮素含量測定方法學 通過對苦蕎提取物中蘆丁、槲皮素含量測定的方法學考察,結果表明空白溶液無雜質干擾,分離度和拖尾因子符合要求,理論塔板數以蘆丁計不少于4000。蘆丁與槲皮素的回歸方程分別為y=21635x+2191(r=1)、y=39015x-8258.5(r=1),結果表明蘆丁、槲皮素分別在0.093～291.2 μg/mL和0.167～259 μg/mL范圍內線性關系良好,其精密度、重復性RSD均小于1.24%,在12 h內兩者穩定性良好。

2.1.2 單因素實驗 由圖1可知，當乙醇百分含量為60%和100%時，苦蕎提取物酸水解后槲皮素總量物顯著性差異，故擇優選擇60%作為苦蕎提取物酸水解的溶媒。固定苦蕎提取物酸水解反應的其他條件不變，以槲皮素含量為評價指標，苦蕎提取物酸水解單因素結果為鹽酸百分含量0.83%、水解時間6 h、乙醇百分含量60%、水解溫度70 ℃。說明苦蕎提取物酸水解需在適宜的酸性環境和適當的時間內完成，這可能與苦蕎提取物中的蘆丁和槲皮素在酸性環境中的穩定性有關。

圖1 單因素條件對苦蕎提取物酸水解后槲皮素含量的影響

2.1.3 正交實驗 苦蕎提取物酸水解正交實驗的極差分析及方差分析結果如表2、表3所示。

表2 正交實驗設計與結果分析

表3 方差分析表

由表2、表3可知,因素A、B、D對酸水解工藝具有顯著性影響,因素C對酸水解工藝無顯著性影響,其影響的主次因素依次是A>D>B>C。從節約成本的目的出發,選擇50%乙醇作為溶媒,即最佳水解工藝條件為A3B2C1D2。在鹽酸百分含量為0.91%、水解時間6 h、50%乙醇、70 ℃條件下酸水解,工藝所需成本相對較低,水解后槲皮素濃度最高可達74.95 μg/mL。由于槲皮素在光照、酸性條件[14]下不穩定,為盡可能保證苦蕎提取物經酸水解后槲皮素含量最高,故酸水解應在一定時間內完成,避免槲皮素的生成速率低于其降解速率,導致提取物中槲皮素總量下降。

2.1.4 苦蕎提取物酸水解樣品 苦蕎提取物經酸水解后,部分蘆丁轉化為槲皮素。在水解過程中隨著水解時間延長,槲皮素含量逐漸增高,水解產物4中蘆丁轉化率可達64.11%。通過樣品采集所得的4份水解產物中蘆丁、槲皮素含量如表4。

表4 苦蕎提取物酸水解蘆丁、槲皮素含量變化及其摩爾比值

2.2 苦蕎提取物藥代動力學

2.2.1 苦蕎提取物藥代動力學方法學結果 專屬性結果如圖2所示,槲皮素保留時間為9.519 min,黃芩素保留時間為11.448 min,分離度良好,血漿內源性雜質無干擾。以槲皮素的血藥濃度為橫坐標,槲皮素峰面積與黃芩素內標峰面積之比為縱坐標進行線性回歸,得y=0.0185x+0.0042(R2=0.999),表明槲皮素在0.028～25.7 μg/mL范圍內線性良好。槲皮素的準確度為93.46%～99.69%,日內、日間精密度RSD值均不大于9.82%,符合生物樣本分析方法的要求。低、中、高三種濃度槲皮素的提取回收率分別為76.20%±4.25%、79.33%±2.86%、75.96%±2.60%,表明該方法的提取回收率良好。血漿樣品在室溫下放置6 h,-20 ℃凍存7 d,其RSD均小于9.36%,經1個凍融周期后RSD均小于8.15%,處理后的分析物在4 ℃,存放24 h后其RSD均小于9.86%,表明生物樣本穩定性良好。

圖2 高效液相色譜圖

2.2.2 苦蕎提取物酸水解樣品藥代動力學研究

藥時曲線:大鼠分別灌胃苦蕎提取物及其酸水解產物后各時間點的血漿樣品經HPLC測定后,得出各實驗組藥時曲線,見圖3。

圖3 大鼠體內槲皮素的平均血藥濃度—時間曲線

藥代動力學參數:各實驗組的槲皮素血藥濃度數據采用DAS 2.0進行藥代動力學參數計算，并通過SPSS 19.0對其進行方差分析得出各實驗組與苦蕎提取物組的藥代動力學參數差異,見表5。

表5 大鼠灌胃苦蕎提取物后槲皮素的藥動學參數

由圖3和表5可得,苦蕎提取物經酸水解后,蘆丁含量逐漸降低,槲皮素含量逐漸增高,其酸水解產物較苦蕎提取物吸收速率加塊、累計吸收量增加。這是由于在水解過程中蘆丁去糖基轉化為槲皮素,其極性減小,脂溶性增加,槲皮素在機體內更容易被小腸絨毛吸收、穿過腸壁、進入血液,從而更易于吸收進入體循環。

蘆丁與槲皮素不僅脂溶性有差異,其在體內的代謝途徑亦有所不同。蘆丁在體內主要為酯水解的Ⅰ相代謝,其在體內黃酮醇母核裂解和糖苷鍵斷裂兩種方式同時進行[15],減少了機體對蘆丁的吸收和利用。而槲皮素在體內為硫酸化和葡萄糖醛酸化的Ⅱ相代謝,槲皮素經Ⅱ相代謝后會生成槲皮素葡萄糖苷,經膽汁排出進入腸道,在腸道內槲皮素葡萄糖苷能夠被腸道菌群完全代謝為槲皮素或其他物質而被腸道重吸收[7],即槲皮素的腸肝循環。而且腸道內的糖苷水解酶只能作用于單分子葡萄糖苷,對雙糖苷無活性[16],故槲皮素葡萄糖苷在腸道內比蘆丁更易吸收[17]。

此外,腸道菌群個體差異也會導致苦蕎提取物中蘆丁在人體內的吸收差異。隨著醫療水平的發展,抗生素濫用造成機體腸道菌群紊亂,由腸道菌群產生的糖苷水解酶不能正常分泌,以致人體不能有效吸收苦蕎提取物中的蘆丁而發揮生物活性。通過酸水解直接將苦蕎提取物中的蘆丁轉化為槲皮素,不僅避免了腸道菌群差異帶來的吸收差異性,而且還有利于提高苦蕎提取物中蘆丁和槲皮素的累計吸收量。

3 結論

以鹽酸百分含量0.91%、水解時間6 h、乙醇百分含量50%、水解溫度70 ℃為工藝條件對苦蕎提取物進行酸水解,苦蕎提取物中的蘆丁可最大程度的轉化為槲皮素。藥代動力學結果表明,苦蕎提取物經酸水解后其進入機體發揮生物活性的苷元槲皮素增多,達峰時間縮短、峰濃度增加。這不僅可改善苦蕎提取物中蘆丁吸收差和吸收慢的現象,而且對于指導苦蕎的提取、深加工,開發高利用率苦蕎產品具有重要意義,同時對于其他類似苷和苷元的產品開發具有借鑒作用。

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