四種不同接觸表面蠟樣芽孢桿菌菌膜形成的影響

夏俊芳,盧 巖,古麗娜孜,馬 瑤,木麗登,禹 凱,劉 霞,李曉燕,王 威,張亞南,武 運

(新疆農業大學食品科學與藥學學院,新疆烏魯木齊 830052)

蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus,簡稱B.cereus)為革蘭氏陽性桿菌,產芽孢,在多種食品(乳制品、蔬菜、大米和肉類)中極易檢出[1],該菌可引起惡心、嘔吐、腹痛和腹瀉等胃腸道疾病[2],嚴重時還會造成其他病原的機會性感染從而引發敗血癥、肺炎和腦膜炎等疾病[3]。B.cereus引起的食物腐敗是食品行業的主要威脅,例如其在巴氏消毒和制冷過程中能夠存活的孢子易使牛奶和牛奶制品造成污染[4]。在食品加工環境中,B.cereus在多種接觸表面(輸送帶、不銹鋼管和儲罐)形成菌膜[5]嚴重危害食品安全,成為潛在的污染產品和再污染源[6]。菌膜(biofilm)是附著于細菌群落表面的胞外多聚物(Extracellular polymeric substance,EPS)[7]。菌膜的形成是一種非常復雜的動態過程，主要包括五個階段:初始可逆附著期,浮游細菌附著于材料表面;不可逆粘附期,菌體分泌EPS形成微團聚集物;菌膜初步形成期,具有一定空間結構的細菌聚集體;菌膜成熟期,空間結構成熟穩定;主動分散期,細菌或小部分菌膜分離并重新附著到新的表面[8]。初始可逆附著期和不可逆粘附期對菌膜形成是至關重要的階段,因為這兩個階段主要完成浮游菌附著在載體表面以啟動菌膜的循環生成任務,所以菌膜的形成與菌體及附著材料的表面特性密切相關,且食品加工環境中豐富的營養成分和有機成分非常有利于菌膜形成,因此研究不同溫度、時間、糖、鹽、pH、防腐劑等諸多因素對于食品工業不同加工設備表面類型菌膜形成的影響及建立菌膜定點清潔(CIP)提供參考。

目前,關于B.cereus菌膜形成影響因素的研究多集中與不銹鋼[9-10]、玻璃[11]等單一接觸材料對B.cereus菌膜形成的影響分析,缺乏食品加工環境因子影響的相關研究。因此,本文以B.cereus為受試菌,以食品工業常用的四種接觸面材料為載體,采用超聲波平板菌落計數法測定各種環境條件下(不同的溫度、pH、氯化鈉、葡萄糖、苯甲酸鈉、山梨酸鉀等)不同材料表面B.cereus菌膜形成變化趨勢,為食品工業B.cereus菌膜的預防和控制奠定基礎,B.cereus風險評估提供基礎數據,改進B.cereus的清洗控制措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蠟樣芽孢桿菌(CMCC63303) 上海理工大學醫療器械與食品學院微生物實驗室;營養瓊脂培養基、LB肉湯培養基 北京陸橋生物技術有限公司;山梨酸鉀、苯甲酸鈉、氯化鈉、葡萄糖、硫酸、氫氧化鈉等 分析純,天津市盛淼精細化工有限公司;不銹鋼(SS)(食品級304,10 mm×10 mm) 深圳市華昌五金模具有限公司;聚氯乙烯(PVC)(10 mm×10 mm)、聚丙烯(PPR)(10 mm×10 mm) 深圳海諾塑膠有限公司;玻璃片(Glass)(10 mm×10 mm) 鹽城市飛舟玻塑有限公司。

SK2200H超聲波清洗器 上海科導超聲儀器有限公司;FE20 PLUS pH計 上海梅特勒托利多儀器有限公司;LDZX-40SCI 型高壓滅菌鍋 上海早安醫療器械廠;LHS-150SC恒溫培養箱 上海森信實驗儀器有限公司;FA2104N 電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液的制備 將B.cereus標準菌株用LB肉湯30 ℃培養18 h后取1 mL純菌液,用無菌蒸餾水依次按10-1～10-7倍比稀釋,共7個濃度梯度(依次標記為1～7號)。取1～7號梯度菌液1 mL加入15 mL的融化并冷卻到45 ℃左右無菌營養瓊脂培養基,冷凝后于30 ℃恒溫培養箱內培養24 h后進行平板計數(各梯度純菌懸液分別設3個重復,并計算三個重復的計數平均值),1～7號梯度菌液計數結果分別為2.3×108～2.3×102CFU/mL,于4 ℃冰箱中貯存備用。

1.2.2 載體的清洗 將載體材料不銹鋼片(SS)、聚氯乙烯片(PVC)、聚丙烯片(PPR)、玻璃片(Glass)用洗滌劑清洗,置于丙酮中超聲15 min,除去表面油脂,再用蒸餾水沖洗干凈后置于75%的乙醇浸泡30 min,蒸餾水沖凈,烘干后滅菌備用。然后放入裝有10 mL LB肉湯的15 mm×150 mm試管中,滅菌備用。

1.2.3 菌膜的培養 將10 mL LB肉湯培養基和載體片(均已滅菌)放入滅菌培養皿中,接入0.1% 的1.0×108CFU/mLB.cereus菌懸液,混合均勻,30 ℃培養,連續培養,隔天換液。

1.2.4B.cereus菌膜活菌計數 前處理及超聲:去除培養24 h菌膜的培養液,用無菌磷酸緩沖溶液反復沖洗,洗去浮游菌,再取10 mL無菌磷酸緩沖液加入到試管中,并用超聲波清洗儀(振蕩頻率為45 Hz)處理15 min。稀釋及培養:從經過超聲波清洗儀處理后的試管中吸取1 mL菌液,沿管壁慢慢注入含有9 mL無菌水的試管內,搖勻,梯度稀釋后制成10-3、10-4、10-5稀釋度的菌懸液,各取1 mL,分別加入培養皿內(每個稀釋度做3個培養皿),再向培養皿中傾注約15 mL融化并冷卻到45 ℃左右無菌營養瓊脂培養基,冷凝后,于30 ℃恒溫培養箱內培養24 h后取出,進行活菌計數。

總菌落數(lgCFU/cm2)=(同一稀釋度3個平皿上的菌落平均數×稀釋倍數×10)/載體片的面積

1.2.5B.cereus菌膜生長曲線的繪制 將11個載體片分別放入裝有10 mL LB肉湯培養基的試管中,滅菌后,冷卻至室溫,分別接入0.1% 的1.0×108CFU/mL的B.cereus菌懸液,將試管放在30 ℃的培養箱中培養2、4、6、8、10、12、16、20、24、48、72 h后,對菌膜進行活菌計數。

1.2.6 不同因素對B.cereus菌膜形成的影響分析 四種材質片為載體材料,以B.cereus菌膜的活菌數Lg(CFU/cm2)為指標,考察各因素(溫度、pH、葡萄糖、氯化鈉、防腐劑)對B.cereus菌膜形成的影響。

1.2.6.1 不同溫度對B.cereus菌膜形成的影響 把載體片分別放入裝有10 mL LB培養基(pH7.0)的試管中,加入0.1 mL初始菌懸液濃度1.0×108CFU/mL的B.cereus菌懸液分別在4、25、30、50、60、70 ℃條件下培養24 h,進行B.cereus菌膜活菌數的測定。

1.2.6.2 不同酸堿對B.cereus菌膜形成的影響 把載體片分別放入pH為3.0、5.0、7.0、9.0、11.0的10 mL LB培養基試管中滅菌,然后加入0.1 mL初始菌懸液濃度1.0×108CFU/mL的B.cereus菌懸液,在30 ℃條件下培養24 h,進行B.cereus菌膜活菌數的測定。

1.2.6.3 不同葡萄糖濃度對B.cereus菌膜形成的影響 把載體片分別放入不同質量分數為0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%葡萄糖的10 mL LB培養基(pH7.0)試管中滅菌,然后加入0.1 mL初始菌懸液濃度1.0×108CFU/mL的B.cereus菌懸液,在30 ℃條件下培養24 h,進行B.cereus菌膜活菌數的測定。

1.2.6.4 不同氯化鈉濃度對B.cereus菌膜形成的影響 把載體片分別放入NaCl濃度分別為0%、0.5%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%、12.0%的10 mL LB培養基(pH7.0)試管中滅菌,然后加入0.1 mL初始菌懸液濃度1.0×108CFU/mL的B.cereus菌懸液,在30 ℃條件下培養24 h,進行B.cereus菌膜活菌數的測定。

1.2.6.5 不同防腐劑濃度對B.cereus菌膜形成的影響 把載體片分別放入不同質量分數為0%、0.02%、0.05%、0.10%、0.15%的食品防腐劑(苯甲酸鈉、山梨酸鉀)的10 mL LB培養基(pH7.0)試管中滅菌,然后加入0.1 mL初始菌懸液濃度1.0×108CFU/mL的B.cereus菌懸液,在30 ℃條件下培養24 h,進行B.cereus菌膜活菌數的測定。

1.3 數據處理

每個實驗重復3次,數據統計分析采用Statistix 8.1(分析軟件,St Paul,MN)軟件包中Linear Models程序,差異顯著性(p<0.05)分析使用Tukey HSD程序,采用Excel 2007整理實驗數據,作圖。

2 結果與分析

2.1 B.cereus菌膜生長曲線

如圖1所示,相同時間內,四種材質表面形成B.cereus菌膜能力的大小順序為:玻璃(Glass)>不銹鋼(SS)>聚氯乙烯(PVC)>聚丙烯(PPR),四種不同材質菌膜粘附數量差異顯著(p<0.05),表明親水性介質更有利于B.cereus菌膜的生成。而通常認為菌體在親水性表面的粘附能力弱于其在疏水表面[12],但Na等[13]發現B.cereus具有高水平疏水性卻是低水平的菌膜形成量,Auger等[14]發現B.cereus菌膜形成量與菌株疏水性沒有相關性,Esther等[15]發現B.cereus菌體是疏水的且不易結合于疏水材料上。在本研究中玻璃和不銹鋼表面菌膜形成量較大,可能是因為表面較粗糙,較多無機物更容易粘附細菌形成菌膜,且B.cereus菌膜胞外分泌物中親水性物質較多,易在親水玻璃表面形成菌膜。

圖1 B.cereus菌膜形成數隨時間的變化

四種材料表面B.cereus菌膜的生長趨勢大致一致,隨著培養時間的增加,菌膜的生物量不斷增加,培養初期(0～2 h)時,菌體開始粘附于接觸表面,數量逐漸增長,此階段為B.cereus在載體的初始可逆附著期;6～8 h,菌體與接觸面相互作用菌膜不斷生成,為菌膜的不可逆粘附期;12～24 h時,菌膜基本形成并趨向成熟,24 h時達最高值:玻璃材質活菌數為6.30 lg(CFU/cm2)、不銹鋼材質活菌數為6.07 lg(CFU/cm2)、聚氯乙烯材質活菌數為5.45 lg(CFU/cm2)、聚丙烯材質活菌數為5.32 Lg(CFU/cm2);24～48 h,隨著培養時間的增加,菌膜生物量增長平穩,為菌膜成熟階段;48～72 h,隨著培養時間的延長,菌膜形成量反而減少,為菌膜主動分散階段。表明24 h為B.cereus菌膜的形成階段,這與Wijman等[16]對B.cereus菌膜形成的研究結果一致(24 hB.cereus表現出顯著菌膜形成而48 h后逐漸產生菌膜分散體),故后續實驗選擇24 h作為菌膜培養時間。

2.2 不同因素對B.cereus菌膜形成的影響分析

2.2.1 不同溫度對B.cereus菌膜形成的影響 由圖2可知,接觸面材料對B.cereus菌膜的形成具有顯著影響(p<0.05),在相同溫度下,四種材質表面形成B.cereus菌膜能力的大小順序為:玻璃(Glass)>不銹鋼(SS)>聚氯乙烯(PVC)>聚丙烯(PPR)。B.cereus菌膜的形成量顯著依賴于培養溫度(p<0.05),30 ℃生長狀況明顯優于其他溫度(4、25、50、60及70 ℃),30 ℃時,四種材質表面菌膜的活菌數均達到最高,玻璃材質表面為6.58 lg(CFU/cm2),不銹鋼材質表面為6.17 lg(CFU/cm2),聚氯乙烯材質表面為5.88 lg(CFU/cm2),聚丙烯材質表面為5.44 lg(CFU/cm2),30 ℃也是浮游態B.cereus的最適生長溫度。60及70 ℃時,四種接觸面菌膜形成量為0 lg(CFU/cm2)。塑料材質(PVC、PPR)在4 ℃菌膜形成量高于50 ℃(p<0.05),而玻璃(Glass)、不銹鋼(SS)材質在50 ℃菌膜形成量高于4 ℃(p<0.05),表明不同接觸面對低溫(4 ℃)、高溫(50 ℃)的菌膜形成量有差異,所以對于不同材質要制定不同的定點清除措施。

圖2 不同培養溫度對B.cereus形成數的影響

2.2.2 不同pH對B.cereus菌膜形成的影響 由圖3可知,不同pH對四種材質表面的菌膜形成量的影響有顯著差異(p<0.05),pH7.0>pH5.0>pH9.0>pH11.0>pH3.0,在pH為7.0時,不同材質的菌膜形成量亦有顯著性差異(p<0.05),大小順序為:玻璃(Glass)>不銹鋼(SS)>聚氯乙烯(PVC)>聚丙烯(PPR),這與Esther[15]實驗結果類似,pH為6.8 的LB培養液B.cereus菌膜形成量是LB培養液菌膜形成量的2.5倍。在本實驗中pH在3.0～7.0時,菌膜形成數隨 pH增加呈不斷上升趨勢,當pH在7.0～11.0 時,菌膜形成數明顯下降(p<0.05),說明在B.cereus菌膜形成中pH起到決定性作用。

圖3 不同pH對B.cereus菌膜形成數的影響

2.2.3 不同葡萄糖濃度對B.cereus菌膜形成的影響 如圖4所示,添加一定濃度(<10.0%)葡萄糖的四種材質表面菌膜形成量均大于不添加葡萄糖的菌膜形成量(p<0.05),大小順序為:玻璃(Glass)>不銹鋼(SS)>聚氯乙烯(PVC)>聚丙烯(PPR)。整體來看,添加葡萄糖有利于B.cereus菌膜形成,即營養豐富的生長培養基可以增強菌膜形成[17],當添加量為4.0%時B.cereus菌膜形成量最大,玻璃材質表面為7.48 lg(CFU/cm2),不銹鋼材質表面為7.33 lg(CFU/cm2),聚氯乙烯材質表面為6.50 lg(CFU/cm2),聚丙烯材質表面為6.38 lg(CFU/cm2),顯著高于0.0%葡萄糖濃度的各材質表面B.cereus菌膜形成量(p<0.05)。這可能是由于加入一定濃度的葡萄糖,不僅提高培養液的營養濃度,而且適當降低了體系pH,使得B.cereus菌膜形成量增大[18]。但當濃度超過4.0%時,菌膜形成量反而降低,即高濃度的葡萄糖產生高滲透壓,抑制B.cereus菌膜的形成。這與Minyeong K等[1]報道的葡萄糖對B.cereus菌膜研究結果一致。

圖4 B.cereus菌膜形成數隨葡萄糖濃度的變化

2.2.4 不同NaCl濃度對B.cereus菌膜形成的影響 由圖5可知,NaCl對B.cereus菌膜形成量的影響,添加0.5% NaCl顯著促進了四種材質表面菌膜的形成(p<0.05),但隨著NaCl添加量的增加,B.cereus菌膜形成量逐漸降低,超過4.0% NaCl濃度的B.cereus菌膜形成量均顯著小于未添加NaCl的菌膜形成量(p<0.05),且隨著NaCl濃度的增大,菌膜形成量逐漸降低,這與Rode等[19]研究結果一致。表明高濃度的NaCl對菌膜形成有抑制作用,這可能是由于高濃度NaCl造成水分活度的下降,破壞了正常細胞功能,造成菌膜形成量的減少,而低濃度NaCl對水分活度無明顯影響,低滲環境對菌膜形成有利。

圖5 B.cereus菌膜形成數隨氯化鈉濃度的變化

2.2.5 不同防腐劑濃度對B.cereus菌膜形成的影響 苯甲酸鈉(pH2.5～4.0)在食品中的限量值為0.2～1.0 g/kg,山梨酸鉀(pH5.0～6.0)在食品中的限量值0.2～2.0 g/kg,由圖6～圖7可知,不同防腐劑對四種材質表面形成B.cereus菌膜能力的影響有顯著差異(p<0.05),大小順序為:玻璃(Glass)>不銹鋼(SS)>聚氯乙烯(PVC)>聚丙烯(PPR)。由圖6可知,不同濃度的苯甲酸鈉的四種材質表面菌膜形成量均是0%>0.02%>0.15%>0.05%>0.10%。由圖7可得,對于玻璃、不銹鋼材質,不同濃度的山梨酸鉀的B.cereus菌膜形成量0%>0.02%>0.05%>0.15%>0.10%,對于塑料材質(PVC、PPR),不同濃度的山梨酸鉀的B.cereus菌膜形成量0%>0.02%>0.15%>0.05%>0.10%,可見,較高濃度(0.15%)山梨酸鉀、苯甲酸鈉菌膜形成量顯著高于較低濃度(0.10%)苯甲酸鈉、山梨酸鉀菌膜形成量(p<0.05)。這可能是因為防腐劑對浮游細胞有防腐殺菌效果但卻對菌膜細胞無根除作用,而當高濃度的非致死濃度的防腐劑更容易增強菌膜對防腐劑的耐受性(據Belessi等[20],Bonez等[21]研究發現菌膜對消毒產品的抵抗力是浮游細胞的1000倍),由此會形成更多的菌膜從而導致防腐失敗,對食品工業帶來更為嚴重的安全問題。因此,定期清潔和消毒是目前預防菌膜污染的主要策略[22]。

圖6 苯甲酸鈉對B.cereus菌膜形成數的影響

圖7 山梨酸鉀對B.cereus菌膜形成數的影響

3 結論與討論

B.cereus可在多種材質(玻璃、不銹鋼、聚氯乙烯、聚丙烯)表面形成菌膜,四種材質表面形成B.cereus菌膜能力的大小順序為:玻璃(Glass)>不銹鋼(SS)>聚氯乙烯(PVC)>聚丙烯(PPR)(p<0.05)。本研究中玻璃和不銹鋼表面菌膜形成量較大,親水表面比疏水表面更易形成B.cereus菌膜。同時在多種食品加工環境因素的影響下也能形成B.cereus菌膜,溫度因素:低溫4 ℃,中溫25、30 ℃,高溫50 ℃均能形成菌膜,其中30 ℃時菌膜形成量最大,此溫度也是浮游菌生長的最佳溫度;酸堿因素:四種接觸材料在pH(3.0、5.0、7.0、9.0、11.0)都可形成B.cereus菌膜,其中pH為7.0時四種材料表面菌膜形成量最大,pH對B.cereus菌膜的形成具有顯著影響作用;葡萄糖因素:添加葡萄糖有利于B.cereus菌膜形成,4.0%葡萄糖濃度四種接觸材料表面菌膜形成量顯著增加(p<0.05),當濃度超過4.0%時,菌膜形成量降低,即高濃度的葡萄糖產生高滲透壓,抑制B.cereus菌膜的形成;NaCl因素:添加低濃度的NaCl(0.5%)對B.cereus形成有促進作用而高濃度的NaCl(大于4.0%)對菌膜形成抑制作用明顯;防腐劑因素:在食品可添加的最高限量防腐劑濃度下,B.cereus在四種材質表面均能形成菌膜,使用0.15%防腐劑B.cereus菌膜形成量高于0.10%防腐劑的菌膜形成量(p<0.05)。

因此,為避免菌膜對食品工業的污染要制定菌膜控制策略。主要從以下幾個方面著手:防止菌體與任一表面之間的粘附形成菌膜,食品企業應多選擇疏水材料或通過材料改性例如超疏水表面材料,已經發現在預防細菌附著和菌膜形成方面有效,如銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌[23-24];材料表面加入抗菌劑涂層,例如抗菌肽、精油、酶劑等涂覆表面殺滅抑制菌體以預防菌膜形成[25-26]。目前,定期清潔和消毒是防止菌膜形成的主要策略,食品工業中,在細菌初始粘附接觸面就進行迅速全面清潔,在菌膜成熟前及時清除,會大大降低食品安全的隱患。

[1]Minyeong Kwon,Mohammad Shakhawat Hussain,Deog Hwan Oh. Biofilm formation ofBacilluscereusunder food-processing-related conditions[J]. Food Science and Biotechnology,2017,26(4):1103-1111.

[2]Kotiranta A,Lounatmaa K,Haapasalo M. Epidemiology and pathogenesis ofBacilluscereusinfections[J]. Microbes and Infection,2000,2(2):189-198.

[3]Hoffmaster AR,Hill KK,Gee JE,et al. Characterization ofBacilluscereusisolates associated with fatal pneumonias:Strains are closely related toBacillusanthracisandHarborB.anthracisvirulence genes[J]. Journal of Clinical Microbiology,2006,44(9):3352-3360.

[4]Meer RR.,Baker J,Bodyfelt FW,et al. PsychrotrophicBacillus591spp. in fluid milk products:A review[J]. Journal of Food Protection,1991,54(12):969-979.

[5]Hussain MS,Oh DH. Substratum attachment location and biofilm formation byBacilluscereusstrains isolated from different sources:Effect on total biomass production and sporulation in different growth conditions[J]. Food Control,2017,77:270-280.

[6]Srey S,Jahid IK,Ha S Do. Biofilm formation in food industries:A food safety concern[J]. Food Control,2013,31:572-585.

[7]Costerton JW,Stewart PS,Greenberg EP. Bacterial biofilms:Acommon cause of persistent infections[J]. Science,1999,284:1318-1322.

[8]Costerton JW,Davies DG,Stoodley P. Biofilms as complex differentiated communities[J]. Annual Review Microbiology,2002,56:187-209.

[9]李南薇,何佩倩,杜冰,等. 培養條件對蠟樣芽孢桿菌生物被膜生長的影響[J]. 食品工業,2012,33(7):108-110.

[10]馬悅,吳謙,吳希陽,等. 培養條件及接觸材料對大米中蠟樣芽孢桿菌生物被膜形成的影響[J]. 食品與發酵工業,2015,41(12):64-68.

[11]夏俊芳,劉霞,李曉燕,等. 脅迫因素對玻璃表面蠟樣芽孢桿菌菌膜形成的影響分析[J]. 食品工業科技,2017,38(7):105-110.

[12]Donlan RM.Biofilms:microbial life on surfaces[J]. Emerging Infectious Diseases,2002,8(9):881-890.

[13]Na-Young Choi,Young-Min Bae,Sun-Yong Lee. Cell surface properties and biofilm bormation of pathogenic bacteria[J]. Food Science and Biotechnology,2015,24(6):2257-2264.

[14]Auger S,Ramarao N,Faille C,et al. Biofilm formation and cell surface properties among pathogenic and nonpathogenicstrains of theBacilluscereusgroup[J]. Applied and Environmental. Microbiology,2009,75(20):6616-6618.

[15]Esther Karunakaran CA Biggs. Mechanisms ofBacilluscereusbiofilm formation:an investigation of the physicochemical characteristics of cell surfaces and extracellular proteins[J]. Applied Microbiol Biotechnology,2011,89(4):1161-1175.

[16]Wijman JGE,De Leeuw PPLA,Moezelaar R,et al. Air-liquid interface biofilms ofBacilluscereus:Formation,sporulation,and dispersion[J]. Applied and environmental microbiology,2007,73(5):1481.

[17]Marwan Abdallah,Corinne Benoliel,Djamel Drider,et al. Biofilm formation and persistence on abiotic surfaces in the context of food and medical environments[J]. Archives of Microbiology,2014,196(7):453-472.

[18]Gao T,Foulston L,Chai Y,et al. Alternative modes of biofilm formation by plant-associatedBacilluscereus[J]. Microbiology Open,2015,4(3):452-464.

[19]Rode T M,Langsrud S,Holck A,et al.Different patterns of biofilm formation inStaphylococcusaureusunder food-related stress conditions[J]. International Journal of food Microbiology,2007,116(3):372-383.

[20]Belessi CEA,Gounadaki AS. Efficiency of different sanitation methods on Listeria monocytogenes biofilms formed under various environmental conditions[J]. International Journal of Food Microbiology,2011,145 Suppl 1(1):S46.

[21]Bonez PC,Santos CF,Dalmolin TV,et al. Chlorhexidine activity against bacterial biofilms[J]. Amerian Journal of Infection Control,2013,41(12):119-22.

[22]Sim?es M,Sim?es LC,Vieira MJ.A review of current andemergent biofilm control strategies[J]. LwT-Food Science Technology,2010,43:573-583.

[23]Peifu Tang,Wei Zhang,Yan Wang,et al. Effect of superhydrophobic surface of titanium on Staphylococcus aureus adhesion[J]. Journal of Nanomaterials,2011(20):3385-3385.

[24]Loo CY,Young PM,Lee WH,et al. Superhydrophobic,nanotextured polyvinylchloride films for delayingPseudomonasaeruginosaattachment to intubation tubes and medical plastics[J].Acta Biomaterialia,2012,8(5):1881-1890.

[25]Glinel K,Thebault P,Humblot v,et al. Antibacterial surfaces developed from bioinspired approaches[J]. Acta Biomaterialia,2012,8(5):1670-1684.

[26]Karam L,Jama C,Dhulster P,et al. Study of surface interactions between peptides,materials and bacteria for setting up antimicrobial surfaces and active food packaging[J]. Journal of Materials and Environmental Science,2013,4(5):798-821.