耙齒菌EA-LJS-73產七葉皂苷培養基配方的響應面法優化

劉軍生,羅陽蘭,解修超,*,鄧百萬,王 嬌,楊玉梅

(1.陜西理工大學陜西省食藥用菌工程技術研究中心,陜西漢中 723001;2.陜西理工大學生物科學與工程學院,陜西漢中723001;3.略陽縣農產品質量安全檢驗檢測中心,陜西漢中 724300)

七葉皂苷具有顯著的抗腫瘤[1]、抗病毒[2]、抗炎消滲[3]、抑制胃酸分泌[4],恢復毛細血管通透性[5],提高靜脈張力[6],改善血液循環[7-8],促進腦細胞恢復[9-10]、清除氧自由基[11]等作用[12]。基于對七葉樹皂苷藥理作用的認識不斷加深,對七葉皂苷的需求也日益增加。而目前國內七葉皂苷主要來自于七葉樹及其果實娑羅子[13],七葉樹雖分布廣泛,但種群較小,總體資源儲量遠不及人們對其醫藥的需求[14],且不同產地的娑羅子品質不一[15],同時用娑羅子提取七葉皂苷生產成本高、污染大、生產周期受限等問題較為突出,導致七葉皂苷相關藥品價格居高不下。

本文對已分離出一株具有產七葉皂苷活性的內生真菌耙齒菌EA-LJS-73,采用Box-Behnken 設計分析確定最優培養基配方并通過發酵動力學實驗進行驗證，以研究發酵過程中菌株的生長速率、培養基的消耗速率和七葉皂形成速率的相互作用和隨時間變化的規律,采用HPLC檢測培養基優化前后發酵液中七葉皂苷的含量變化進行對比。以期通過本研究為后期七葉皂苷的生產提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

耙齒菌EA-LJS-73(Irpexsp.) 由陜西理工大學陜西省食藥用菌工程技術研究中心分離并保藏,菌絲白色,氣生菌絲發達,生長后期有大量黃色分泌物,菌絲系統為二體型,生殖菌絲透明具簡單隔膜,直徑3～4 μm,具鎖狀聯合,營養菌絲壁厚,直徑1～3 μm，囊狀體顯著8 μm×15 μm,棒狀壁厚，結晶體近方形(10～20) μm×(8～12) μm；液體發酵基礎培養基(1 L):葡萄糖20 g,蛋白胨5 g,MgSO45 g,起始pH7.0；滅菌條件為:103.4 kPa(1.05 kg/cm2)蒸汽壓下,溫度121 ℃,持續滅菌25 min；七葉皂苷標品 純度>95%,購自上海生工;甲醇、磷酸、乙腈 均為國產色譜純;其余試劑 均為國產分析純。

EYELA N100 O型旋轉蒸發儀 上海愛郎儀器有限公司;SW-CJ-1D型單人超凈工作臺 上海蘇凈實業有限公司;YXQ-LS-50S型高壓滅菌鍋 上海博訊實業有限公司醫療設備廠;超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;UV2550型紫外分光光度計 日本島津公司;HP1100型HPLC儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 耙齒菌EA-LJS-73發酵條件 溫度28 ℃,轉速120 r/min,250 mL三角瓶中裝液體發酵基礎培養基150 mL,接入種子液,接種量為2%,發酵時間7 d。

1.2.2 菌絲體生物量的測定 將發酵完成后的菌絲體過濾后用無菌水沖洗三遍,置于烘箱中40 ℃烘干至恒重,稱重。

1.2.3 七葉皂苷定量測定

1.2.3.1 發酵液的處理 將菌株EA-LJS-73接入液體搖瓶中,振蕩發酵7 d,超聲處理(功率為160 W,頻率為40 kHz)30 min,抽濾,收集發酵液用乙酸乙酯充分萃取發酵液,收集下層水相再用正丁醇萃取,收集正丁醇層,重復兩次,合并濾液,旋轉蒸發儀蒸干,用甲醇溶解并定容于100 mL容量瓶中,經D101大孔吸附樹脂柱,依次用水、30%乙醇、70%乙醇進行梯度洗脫,收集70%乙醇流分[16],低壓旋轉蒸發至干,加色譜級甲醇定容至100 mL,配制成提取物儲備液,4 ℃冰箱保存備用。

1.2.3.2 樣品顯色液制備 香草醛-冰醋酸-高氯酸法[17]:取樣品溶液1 mL,置于具塞試管中,50 ℃水浴加熱,揮干甲醇后加入5%香草醛-無水冰醋酸溶液0.2 mL,70%高氯酸0.8 mL,搖勻,70 ℃水浴加熱15 min,取出后用冷水終止反應10 min,加9 mL無水甲醇稀釋,混勻后備用。

1.2.3.3 全波長掃描和標準曲線的繪制 精確稱取七葉皂苷標準品10 mg,用無水甲醇定容至10 mL,配制1 mg/mL標準溶液,取1 mL于10 mL具塞試管中,按1.2.3.2方法處理溶液后,在500～700 nm波長范圍內進行全波長掃描。

分別移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL標準溶液于10 mL具塞試管中,按1.2.3.2方法處理,混勻后在551 nm處測定吸光度,并繪制標準曲線。

1.2.4 培養基優化

單因素實驗：以0.2%的蔗糖、淀粉、乳糖、麥芽糖分別代替基礎培養基中的葡萄糖作為碳源,培養7 d后,抽濾,60 ℃烘干至恒重,稱取菌絲體干重為生物量,考察不同碳源對七葉皂苷濃度影響。

以0.2%的淀粉為碳源,以0.2%的酵母浸粉、硫酸銨、尿素和硝酸鉀分別代替基礎培養基中的蛋白胨作為氮源,考察不同氮源對七葉皂苷濃度的影響。

以0.2%的淀粉為碳源,0.2%的酵母浸粉為氮源,以0.5%的氯化鉀、硫酸錳、氯化鈣和0.05%的硫酸亞鐵分別代替基礎培養基中的MgSO4,考察不同無機鹽對七葉皂苷濃度的影響。

1.2.5 響應面法實驗 在單因素實驗的基礎上,根據Box-Behnken的中心組合實驗設計原理[18],選取淀粉(A)、酵母浸粉(B)、MgSO4(C)為變量,以七葉皂苷濃度為響應值,每個變量按低、中、高3個水平分別以-1、0、+1進行編碼[19]。

實驗因素及水平見表1。

表1 響應面分析因素和水平

1.2.6 HPLC驗證優化前后七葉皂苷濃度 HPLC檢測條件:色譜柱C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),紫外檢測波長220 nm,流動相為乙腈∶0.2%磷酸(體積比為37∶63),進樣量20 μL,流動相流速為1 mL/min,柱溫25 ℃[20]。

1.2.7 菌株EA-LJS-73的發酵動力學分析實驗 把菌株EA-LJS-73接入發酵培養基進行搖瓶培養,每隔24 h取樣檢測其各項發酵參數如生物量和七葉皂苷濃度。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 七葉皂苷定量測定

2.1.1 全波長掃描 通過香草醛-冰醋酸-高氯酸法,七葉皂苷標準品顯色后全波長掃描結果見圖1,七葉皂苷標準品在紫外最大吸收波長為551 nm。

圖1 七葉皂苷標準品全波長掃描圖

2.1.2 七葉皂苷標準曲線 以七葉皂苷濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標做出標準曲線,得標準曲線回歸方程為Y=7.9681X+0.8845,R2=0.9955,將不同樣品的OD值代入方程計算樣品所含七葉皂苷濃度。

2.2 單因素實驗

2.2.1 碳源的影響 由圖2可知,菌株EA-LJS-73能利用不同碳源生產七葉皂苷,尤其是以淀粉作為碳源時,每升發酵液中生物量能達到10.351 g,七葉皂苷濃度為0.946 g/L,且菌絲球緊密,發酵液粘稠度高,其次是葡萄糖>乳糖>麥芽糖>蔗糖。這是由于菌株EA-LJS-73在受到不同底物的刺激后所表達的基因不同或是基因表達量不同導致產量不同,在以淀粉為碳源時,菌株EA-LJS-73的生物量和七葉皂苷濃度達到最大。

圖2 碳源對菌株EA-LJS-73的影響

2.2.2 氮源的影響 由圖3可見,菌株EA-LJS-73能利用不同氮源產生七葉皂苷,其中酵母浸粉為氮源時生物量最大,達到10.635 g,七葉皂苷濃度也達到峰值0.968 g/L,其次是蛋白胨>尿素>硫酸銨>硝酸鉀。氮源主要用于菌體細胞器(細胞膜、內質網等)和含氮代謝物的合成,合適的氮源可促進菌體生長及代謝產物的生成。

圖3 氮源對菌株EA-LJS-73的影響

2.2.3 無機鹽的影響 由圖4可見,在供試無機鹽中添加硫酸鎂時,菌絲球長速最快,生物量最大,為9.036 g,七葉皂苷濃度也達到峰值0.819 g/L,其次是硫酸錳>氯化鈣>氯化鉀>硫酸亞鐵。硫酸鎂在菌體生長過程中提供大量鎂離子,而鎂離子是許多酶的重要組成部分,因此菌絲生長快速,次生代謝產物合成較快。

圖4 無機鹽對菌株EA-LJS-73的影響

2.3 響應面實驗結果及數據分析

2.3.1 實驗設計方案及結果 根據單因素實驗結果,由Design-Expert 8.0.6統計分析軟件設計出的實驗方案及實驗結果如表2所示,以七葉皂苷濃度為響應值(Y),以淀粉(A)、酵母浸粉(B)、MgSO4(C)為自變量,建立三因素三水平中心組合實驗設計共包括15個實驗方案,其中有3個中心實驗點,用以計算實驗誤差。

表2 響應面分析實驗方案及結果

2.3.2 回歸方程擬合及方差分析 采用Design-Expert8.0.6軟件對所得數據進行二次回歸分析,分析結果見表3,對各因素回歸擬合后,得到二次回歸方程如下:

表3 回歸方程的方差分析結果

Y=1.03-0.039A-0.15B+0.27C-0.070AB-0.11AC-0.057BC-0.13A2-0.15B2-0.44C2

2.3.3 響應面圖分析 根據回歸方程繪制七葉皂苷濃度隨各因素變化的響應曲面圖[21]。由響應曲面圖可知淀粉、酵母浸粉、MgSO4這3個因素對七葉皂苷濃度的影響(圖5～圖7)。每個響應曲面分別代表著兩個獨立因素間的相互作用,另一個因素保持在編碼水平的0水平[22]。

圖5結果顯示,淀粉和酵母浸粉的交互作用顯著。在淀粉質量一定條件下,隨著酵母浸粉質量的增加,七葉皂苷的濃度會緩慢升高至平穩,然后迅速下降。在酵母浸粉質量一定的條件下,隨著淀粉質量的增加,七葉皂苷濃度會迅速升高至平穩,然后略有下降。

圖5 Y=f(AB)響應面和等高線

圖6結果顯示,淀粉質量和無機鹽質量的交互作用極顯著。在低淀粉質量條件下隨著無機鹽質量的增加,七葉皂苷濃度會緩慢升高至平穩,然后略有下降;在高淀粉質量條件下,隨著無機鹽質量的增大,七葉皂苷濃度會迅速升高,最后趨于平穩。無機鹽質量較低條件下,隨著淀粉質量的增大,七葉皂苷濃度緩慢升高至平穩,然后迅速下降;在無機鹽質量較高條件下,隨著淀粉質量的增大,七葉皂苷濃度迅速升高至平穩,然后下降。

圖6 Y=f(AC)響應面和等高線

圖7結果顯示,酵母浸粉質量和無機鹽質量的交互作用顯著。在低酵母浸粉質量條件下隨著無機鹽質量的增加,七葉皂苷濃度會緩慢升高至平穩,然后略有下降;在高酵母浸粉質量條件下,隨著無機鹽質量的增大,七葉皂苷濃度會迅速升高,最后趨于平穩。無機鹽質量較低條件下,隨著酵母浸粉質量的增大,七葉皂苷濃度緩慢升高至平穩,然后迅速下降;在無機鹽質量較高條件下,隨著酵母浸粉質量的增大,七葉皂苷濃度迅速升高至平穩,然后下降。

圖7 Y=f(BC)響應面和等高線

圖5～圖7直觀地反映了各因素對響應值的影響,由圖可知:淀粉和酵母浸粉的交互作用顯著，淀粉質量和無機鹽質量之間有極顯著的交互作用，酵母浸粉質量和無機鹽質量之間也有顯著交互作用。并且可得出A、B、C存在極值點,Y的最大估計值為1.116 g/L,對應的因素濃度為淀粉22.660 g/L,酵母浸粉4.230 g/L,MgSO47.600 g/L,即為最優培養基配方。

為了驗證響應面分析的可靠性,采用上述最佳工藝參數進行驗證實驗,用菌株EA -LJS-73進行3次平行,培養7 d后采用HPLC定量測定驗證,優化后七葉皂苷濃度平均值為1.105 g/L,與優化前的基礎培養基相比菌株產七葉皂苷的能力提高了35%。結果表明,經過響應回歸方程擬合出的理論值與實際值相吻合,證明用響應面法可以有效的優化培養基,促使七葉皂苷的產量得到了極大程度的提高,為發酵生產七葉皂苷奠定了基礎。

2.4 菌株EA-LJS-73的發酵動力學分析

從EA-LJS-73的發酵曲線(圖8)可以看出,七葉皂苷濃度和生物量的增長曲線基本一致,發酵培養2 d后進入快速增長期,七葉皂苷濃度隨著生物量的增加而增加。發酵培養6 d后進入穩定生長期,七葉皂苷開始大量積累。在10 d時,生物量和七葉皂苷濃度達到最大值,分別為11.376 g(菌體干重)和1.665 g/L,此時為發酵終點。達到發酵終點以后,生物量和七葉皂苷濃度均開始下降,可能是因為淀粉將消耗盡,菌體自溶,七葉皂苷被當做碳源被菌體利用。

圖8 菌株EA-LJS-73發酵曲線

3 結論

采用 Box-Behnken設計對產七葉皂苷菌株EA-LJS-73發酵條件進行優化,建立了七葉皂苷濃度回歸模型,由該模型優化的發酵條件(1 L)為:淀粉22.660 g,酵母浸粉4.230 g,MgSO47.600 g,七葉皂苷濃度的理論值可達到1.116 g/L。在此條件下,通過驗證實驗測得最適培養基發酵生成的七葉皂苷濃度為1.105 g/L,菌株產七葉皂苷的能力提高了35%,與模型預測結果相近,進一步驗證了模型的可靠性。之后對高產菌株的發酵特性進行動力學研究,得出在10 d時,菌體生物量和七葉皂苷濃度達到最高,此時達到發酵終點,生物量為11.376 g(菌體干重),而七葉皂苷濃度達到1.665 g/L,證明本實驗優化的結果,具有實際意義。

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