響應面法優化乳酸片球菌凍干保護劑配方

周小兵,林路英,彭 燦,何小芬,李 卉,蘇 敦,*

(1.深圳市華大農業應用研究院,廣東深圳 518083;2.深圳華大生命科學研究院,廣東深圳 518120)

乳酸片球菌,能夠產生片球菌素[1],具有抑菌[2]、降低膽固醇[3]等益生功能,主要應用在食品發酵[4]、防腐[5]等方面。益生菌是指通過攝取適當的量,對宿主的身體健康能發揮有益作用的活菌[6],近年來由于益生菌在調節腸道、增強免疫力、降低膽固醇、抗癌等方面的功能逐漸被發現[7],其研究和應用越來越受到廣泛關注。國家衛生計生委于2014年4月16日發布公告批準乳酸片球菌為新食品原料[8],乳酸片球菌在我國正式被納入可食用益生菌范疇,大大拓展了乳酸片球菌的應用空間。

真空冷凍干燥是生產和保存活細胞最有效的方法之一,在低溫下凍結物料使之成為固態,然后在真空環境下使水分直接升華從而實現物料干燥[9]。真空冷凍干燥是冷凍和干燥技術的有機結合,菌體在凍干過程中會經歷冷凍和干燥兩個過程的刺激,不可避免的會造成損傷[10]。由于冷凍而導致對生物系統的損傷主要來自于兩個方面,即細胞膜脂肪酸物理性狀的改變和相關蛋白結構的改變,干燥過程對益生菌細胞造成損傷的兩大根源是膜的融合與脂質的相轉變[11]。凍干前在菌懸液中加入適當的保護劑能有效避免冷凍和干燥過程中的細胞損傷,從而提高細胞的存活率[12]。朱奇奇等[13]采用海藻糖、谷氨酸鈉、蔗糖、脫脂乳粉作為植物乳桿菌凍干保護劑,存活率達到83.32%;沈頤涵[14]以脫脂奶粉、甘露醇、VC-Na、味精為保護劑,嬰兒雙歧桿菌凍干存活率由43%提高到85.42%;許娜等[15]通過添加脫脂奶粉、海藻糖、甘油作為保護劑,鼠李糖乳桿菌的凍干存活率為86.69%。凍干存活率不僅受保護劑影響,微生物自身特性也會影響凍干效果,不同微生物最合適的保護劑成分和保護劑配方不同[16]。

本研究以實驗室篩選的專利菌株乳酸片球菌為研究對象,采用響應面法進行研究,以確定最佳凍干保護劑配方,為乳酸片球菌的應用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳酸片球菌 中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏編號CGMCC10512;海藻糖、甘露醇 生工生物工程有限公司;硫酸錳 天津市大茂化學試劑廠;抗性淀粉 西安沛森生物科技有限公司;茶粉 廣東天池茶業股份有限公司;MRS培養基 美國BD DIFCO；實驗所用試劑 均為分析純。

Alpha 1-4 LD plus真空冷凍干燥機 德國Christ;壓力蒸汽滅菌器 山東新華醫療器械股份有限公司;5810R冷凍高速離心機 德國Eppendorf;生化培養箱 上海精宏實驗設備有限公司;DW-86L490超低溫保存箱 青島海爾股份有限公司;Vortex-5渦旋振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司、pHS-3C pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌體培養 甘油管保藏的菌體在MRS固體培養基平板上劃線,37 ℃培養24 h,挑取單菌落轉接到液體MRS培養基,37 ℃靜置培養12 h,以1%的接種量轉接,37 ℃靜置培養12 h。

1.2.2 活菌計數 將發酵液用無菌生理鹽水進行梯度稀釋,選擇合適的梯度采用滾珠法涂布平板,37 ℃培養48 h進行菌落計數,計算發酵液中活菌數量。

1.2.3 冷凍干燥 菌液經4000 r/min、4 ℃離心10 min,棄上清,加等體積0.85%的生理鹽水懸浮,相同條件下再次離心,棄上清液,濕菌體與一定配比的保護劑以1∶6的比例再懸浮,置于4 ℃冰箱預凍1 h,再置于-20 ℃冰箱預凍1 h至固化,然后轉移到-80 ℃冰箱凍結1 h。凍干機開機預凍5 min至溫度降為-55 ℃,將處理好的菌體轉移至凍干機凍干24 h,即獲得凍干粉[17]。

1.2.4 Plackett-Burman實驗 選取海藻糖濃度、甘油濃度、甘露醇濃度、可溶淀粉濃度、抗性淀粉濃度、乙酸鈉濃度、硫酸錳濃度、茶粉濃度八個因素設計Plackett-Burman實驗,按表2配方配制保護劑,冷凍干燥,比較凍干存活率。

表1 Plackett-Burman實驗因素與水平(g/L)

表2 Box-Behnken實驗因素與水平

1.2.5 最陡爬坡實驗 響應面擬合方程只有在考察區域才能充分近似真實情形,首先需要逼近最佳區域后才能建立有效的響應面擬合方程。針對Plackett-Burman實驗所得顯著因素海藻糖濃度、甘露醇濃度、硫酸錳濃度,根據效應的大小及正負設定步長和變化方向,設計實驗,冷凍干燥,比較凍干存活率。

1.2.6 Box-Behnken響應面實驗 以凍干存活率為響應值,針對顯著影響因素海藻糖濃度、甘露醇濃度、硫酸錳濃度設計Box-Behnken實驗,按表2因素與水平配制保護劑,冷凍干燥,比較凍干存活率。

1.3 數據處理

采用Minitab軟件進行Plackett-Burman實驗設計并進行顯著性分析;采用Design Expert軟件設計Box-Behnken實驗,對數據進行方差分析及二次多項回歸擬合。

2 結果與討論

2.1 Plackett-Burman實驗篩選顯著影響因素

根據表3結果比較各因素顯著性,結果見表4。

表3 Plackett-Burman實驗設計及結果

表4 Plackett-Burman實驗各因素效應評價

由表4可知，各因素對凍干存活率影響顯著性排列：海藻糖濃度>甘露醇濃度>硫酸錳濃度>甘油濃度>可溶淀粉濃度>茶粉濃度>乙酸鈉濃度>抗性淀粉濃度,其中海藻糖濃度、甘露醇濃度、硫酸錳濃度對凍干存活率影響顯著。眾多研究表明海藻糖能對微生物細胞起很好的保護作用[17-19],關于海藻糖、甘露醇等多羥基物質,其保護作用有幾種假說:一種是改變了膜相變溫度,當磷脂干燥脫水時,海藻糖在失水部位以氫鍵和磷脂的極性端相連,防止狀態的轉變和復水時的滲漏,從而提高存活率[20];另一種是影響體系玻璃化轉變溫度,海藻糖能夠促進玻璃體的形成,減少對蛋白質及細胞有破壞作用的冰晶的生成,從而提高被保存物質的穩定性[21]。海藻糖t值為負說明對響應值有負效應,濃度應遞減,甘露醇和硫酸錳為正,濃度應遞增。

2.2 最陡爬坡實驗研究最大響應值的響應區域

通過Plackett-Burman實驗篩選出了對菌體凍干存活率影響最大的三個因素:海藻糖濃度、甘露醇濃度、硫酸錳濃度,最陡爬坡實驗設計及結果如表5所示，海藻糖濃度70 g/L,甘露醇濃度40 g/L,硫酸錳濃度1.5 g/L在最大響應值區間。

表5 最陡爬坡實驗設計及結果

2.3 Box-Behnken實驗設計結果及響應面分析

表6顯示了Box-Behnken實驗結果,對其進行方差分析,結果如表7所示。

表6 Box-Behnken實驗設計結果

表7 Box-Behnken實驗結果方差分析

圖1 海藻糖和甘露醇交互作用對菌體存活率影響的響應面及等高線圖

圖2 海藻糖和硫酸錳交互作用對菌體存活率影響的等高線及響應面圖

圖3 硫酸錳和甘露醇交互作用對菌體存活率影響的等高線及響應面圖

以存活率最高為條件進行優化,得到最優解:海藻糖濃度為73.64 g/L,甘露醇濃度為43.76 g/L,硫酸錳濃度為1.91 g/L,預測凍干存活率為98.72%。采用優化得到的結果進行三次凍干驗證實驗,得到存活率為98.10%±1.03%,與預測值接近,說明該優化方法可信度較高,可以用來進行保護劑配方的篩選和優化。

3 結論

本研究通過響應面法篩選和優化了乳酸片球菌冷凍干燥保護劑配方。首先通過Plackett-Burman實驗研究8種保護劑成分對凍干存活率的影響,從中找出了影響顯著的三個因素:海藻糖濃度、甘露醇濃度、硫酸錳濃度。然后通過最陡爬坡實驗逼近了最大響應區域,最后通過Box-Behnken實驗擬合出一個三元二次多項式方程,找到了最佳配方:海藻糖濃度為73.64 g/L,甘露醇濃度為43.76 g/L,硫酸錳濃度為1.91 g/L,其中海藻糖濃度和甘露醇濃度具有顯著的交互作用,將優化的配方進行凍干驗證,乳酸片球菌凍干存活率為98.10%±1.03%，與預測值98.72%接近。該配方存活率高,具有較高應用價值。

[1]Porto M C W,Kuniyoshi T M,Azevedo T M K,et al.Pediococcusspp.:An important genus of lactic acid bacteria and pediocin producers[J]. Biotechnology Advances,2017,35(3),361-374.

[2]丁成為. 乳酸片球菌素抑菌譜及應用性研究[D]. 天津:天津大學,2007.

[3]Mandal V,Sen S,Mandal N C. Effect of prebiotics on bacteriocin production and cholesterol lowering activity ofPediococcusacidilacticiLAB 5[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology,2009,25:1837-1847.

[4]方炎鵬. 臘魚發酵劑的研制及其應用[D]. 武漢:華中農業大學,2011.

[5]董婷. 乳酸片球菌培養基優化、益生特性及在豬肉防腐中的應用[D]. 天津:天津大學,2014.

[6]FAO/WHO. Evaluation of health and nutritional properties of probiotics in food including powder milk with live lactic acid bacteria[R]. Argentina:FAO/WHO,2001.

[7]肖平,呂嘉櫪,沈文. 益生菌的保健功能及其在食品中的應用概述[J]. 食品科技,2009,34(10):23-26.

[8]國家衛生計生委.關于批準殼寡糖等六種新食品原料的公告[EB/OL]http://www.moh.gov.cn/sps/s7890/201405/

367ce408981e4807809e107417b3d361.shtml.

[9]李華. 真空冷凍干燥微生物的研究進展[J]. 微生物學通報,2002,29(3):78-81.

[10]Sadikoglu H,Ozdemir M. Freeze-dring of pharmaceutical products[J]. Drying Technology,2006,24(7):849-861.

[11]任艷,邵玉宇,張和平,等. 真空冷凍干燥過程中保護劑對乳酸菌的保護機理[J]. 中國乳品工業,2013,41(9):41-45.

[12]Rathnayaka R M. Effect of freeze-drying on viability and probiotic properties of a mixture of probiotic bacteria[J]. ARPN Journal of Science and Technology,2013,3(11):1072-1078.

[13]朱奇奇,張弛翔,王周,等. 降膽固醇植物乳桿菌I4菌凍干保護劑的響應面優化研究[J]. 食品科技,2016,41(11):2-7.

[14]沈頤涵. 嬰兒雙歧桿菌凍干保護劑配方的篩選與優化[J]. 上海醫藥,2014,35(23):66-70.

[15]許娜,劉青梅,楊性民. 響應面法優化鼠李糖乳桿菌凍干保護劑配方的研究[J]. 食品工業科技,2012,33(1):207-210.

[16]牛曉影,鄧麗莉,曾凱芳. 保護劑在微生物真空冷凍干燥中的應用[J]. 食品工業科技,2015(1):390-399.

[17]Tripathi M K,Giri S K. Probiotic functional foods:survival of probiotics during processing and storage[J]. Science Direct,2014(9):225-241.

[18]邢蕾,吳暉,劉冬梅,等. 干酪乳桿菌鼠李糖亞種凍干保護劑的研究[J]. 中國乳品工業,2009,37(11):15-17.

[19]Crowe J H,Oliver A E,Tablin F. Is there a single biochemical adaptation to anhydrobiosis[J]. Inegrative and Comparative Biology,2002,42(3):497-503.

[20]Samuel B L,Eitan I,Bruce L,et al. Trehalose and sucrose protect both membranes and proteins in intact bacteria during drying[J]. Applied and Environmental Microbiology,1995,61(10):3592-3597.

[21]鐘芳. 食品的冷凍玻璃化保藏[J]. 食品與機械,2000,79(5):9-11.