樂果和銅、砷（Ⅲ）對費氏弧菌的聯合毒性效應研究

李雪飛 黃永炳 袁孟杰 孟一鳴 徐恒蒲

摘 要：在實驗室條件下，研究3種污染物質銅（Cu）、砷（As）和農藥樂果（Dimethoate）對費氏弧菌（V. fischeri）的單一毒性和聯合毒性效應。單一毒性實驗結果表明，3種污染物質對費氏弧菌的毒性大小為Cu>As（Ⅲ）>樂果。3種物質對費氏弧菌的15min半數致死濃度（Median effective concentration，EC50）分別為2.04、5.23、523.99mg/L。利用毒性單位（Toxicity unit， TU）法、相加指數（Additive index， AI）法和混合毒性指數（Mixtures toxicity index， MTI）法對混合樣本進行了定性評價，結果表明，在二元混合體系中，不同毒性單位的樂果與Cu均表現為協同作用，不同毒性單位的樂果與As（Ⅲ）部分表現為拮抗作用。樂果-Cu-As（Ⅲ）的三元混合體系的聯合作用表現為部分相加作用和協同作用。

關鍵詞：樂果；銅；砷；聯合毒性；費氏弧菌

當今世界，在農業和工業生產中，重金屬和有機物質被大量使用。隨著諸如Cu、As等有毒重金屬和農用化學品如有機農藥、人工飼料和化肥先后或同時進入自然環境，并通過各種途徑直接或間接進入水體，彼此產生聯合作用，從而對水體環境造成復合污染[1]。發光細菌是一種能夠發出可見光的細菌，利用其發光強度的變化，可以反映環境中的綜合毒性[2]。發光細菌毒性檢測法具有操作簡單、反應迅速、結果靈敏、穩定性高等優點，故被廣泛地運用到環境中污染物質的毒性檢測領域。目前利用發光菌作為受試生物對重金屬和有機磷農藥聯合毒性的研究內容涉及較少，深度較淺。而由于對重金屬和有機磷農藥的混合體系聯合作用效應未知，導致重金屬和有機磷農藥的混合物已經對環境造成了嚴重的破壞，因此，進行重金屬和有機農藥的聯合毒性效應研究刻不容緩。

本實驗使用費氏弧菌作為受試生物，使用三種評價方法評價基于樂果和銅、砷（Ⅲ）的聯合毒性效應，為環境影響評估提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑

GloMax20/20型生物發光檢測儀；高壓滅菌鍋；恒溫培養箱；恒溫振蕩箱；費氏弧菌（V. fischeri）凍干粉購于北京濱松光子技術股份有限公司；樂果，有效成分含量為50%；硫酸銅（CuSO4·5H2O），分析純；三氧化二砷（As2O3），分析純。

1.2實驗方法

1.2.1單一毒性的測定

配制不同濃度的待測液。每個濃度設置一個空白對照組和三個平行實驗組，按菌液體積：待測溶液體積=1：9，測量15min后，費氏弧菌的發光強度，并計算其發光抑制率。

1.2.2聯合毒性的測定

采用等毒性濃度配比法[3]，以樂果+Cu、樂果+As（Ⅲ）毒性單位比分別為1：1、1：2、2：1的比例設置質量濃度梯度，以樂果+Cu+As（Ⅲ）毒性單位比分別為1：1：1、2：1：1、1：2：1、1：1：2的比例設置濃度梯度，測定混合物對費氏弧菌的聯合毒性效應。

1.3聯合毒性的評價方法

1.3.1毒性單位（TU）法

式中：Ci為造成生物半致死時混合物中的i組分的濃度；EC50，i為單一受試樣本i的EC50值。TUi為混合污染物中的i組分的毒性單位，TUi，max為混合物中各組分的毒性單位最大值。利用M與M0來評價聯合毒性效應類型：M=1時為簡單相加作用；1M0時為拮抗作用。

1.3.2相加指數（AI）法

當M≤1時，AI=1/M-1；當M>1時，AI=1-M。AI法的評價標準為：當AI=0時，為相加作用；當AI<0時，為拮抗作用；當AI>0時，為協同作用。

1.3.3混合毒性指數（MTI）法

MTI=1-lgM/lgM0

基于MTI值的評價標準為：當MTI=1時，為簡單相加作用；當MTI<0時，為拮抗作用；當MTI>1時，為協同作用；當0

2 結果與討論

作用15min時，樂果、Cu和As（Ⅲ）對費氏弧菌的EC50分別為523.99、2.04、5.23mg/L。

2.1二元聯合毒性效應研究

樂果分別與Cu、As（Ⅲ）對費氏弧菌的二元聯合毒性效應實驗結果如表1所示。

分別使用TU法、AI法和MTI法評價受試物的聯合毒性，結果如表2、表3所示。

在樂果-Cu的二元混合體系中，三種評價方法均表現為協同作用。由表2可知，隨著Cu的比例的提高，M值遞減，AI值遞增，表明在樂果-Cu的混合體系中，Cu濃度越高，協同作用程度越大。其原因可能是樂果溶液呈弱酸性，會在一定范圍內降低混合溶液的pH，故導致Cu2+的解析量增大。另外，Cu2+在混合物中所占比例大、濃度高時，會導致膜脂質過氧化，細胞膜的通透性上升[4]，利于Cu2+和樂果滲入細胞膜內產生毒害作用，使得二元毒性逐漸增強。

由表3可以得出，在樂果-As（Ⅲ）的二元混合體系中，當樂果所占比例較少時，TU法和MTI法的評價結果均為部分相加作用，而AI法的評價結果為拮抗作用；當樂果所占比例較大時，三種評價方法的結果均為拮抗作用。其原因可能是樂果溶液呈弱酸性，As（Ⅲ）在溶液中是以AsO3-3的形式存在的，當混合溶液中樂果的比例較大時，H+的濃度也較大，故此時，溶液中的AsO3-3較容易與H+結合生成較為穩定的H3AsO3，而大部分的化學物質在以穩定的化合態形式存在時的毒性小于其在以離子態形式存在時的毒性，故此時，混合溶液的毒性出現了一定程度的減弱，所以當樂果所占比例較大時，三種評價方法的結果均表現為輕微的拮抗作用。

2.2三元聯合毒性效應研究

樂果-Cu-As（Ⅲ）三元混合體系聯合毒性評價結果如表4、5所示。

由表5可知，在樂果-Cu- As（Ⅲ）的三元混合體系中，當混合物中Cu2+所占比例較高時，三種評價方法結果均表現為協同作用，而當混合物中Cu2+所占比例較低時，TU法與MTI法的評價結果均為部分相加作用，AI法的評價結果為拮抗作用，表明此時協同作用減弱。其原因可能是在樂果-Cu-As（Ⅲ）三元體系中，樂果與Cu表現為協同作用，樂果與As（Ⅲ）表現為拮抗作用，而樂果與Cu的協同作用程度大于樂果與As（Ⅲ）的拮抗作用程度，另外，Cu2+可以增加細胞膜的通透性，故當混合比例為1：1：1和1：2：1時，混合體系表現為協同作用。而當混合溶液中樂果和砷的比例較大時，Cu2+濃度較低，細胞膜的通透性可能會微弱上升，但并不足以使毒性物質直接進入細胞內，故此時協同作用程度較小，混合體系表現出部分相加作用，另外，當混合體系中樂果所占比例越高時，其與砷發生的拮抗作用越強，故混合體系越偏向于拮抗作用。

3 結論

（1）在單一毒性物質的作用下，15min時，樂果和Cu、As（Ⅲ）對費氏弧菌的EC50分別為523.99、2.04、5.23mg/L。毒性大小順序依次為Cu>As（Ⅲ）>樂果。

（2）在二元聯合毒性效應實驗中，不同毒性單位的樂果與Cu均表現為協同作用，樂果與As（Ⅲ）表現為部分相加作用與拮抗作用。在三元聯合毒性效應實驗中，樂果-Cu-As（Ⅲ）表現為部分相加作用和協同作用。上述的實驗結果均表明混合后毒性在大多數情況下均有一定程度的增強，在生產中需要引起重視。

（3）若混合體系中毒性物質的種類相同，但毒性配比不同，其對費氏弧菌的聯合毒性作用也不完全相同，有時可能存在較大的差異。這說明在混合體系中，隨著某種物質的比例發生改變，其聯合作用也會隨之而發生變化。

參考文獻

[1]潘攀，楊俊誠，鄧仕槐，等. 重金屬與農藥復合污染研究現狀及展望[J].農業環境科學學報， 2011， 30（10）：1925-1929.

[2]Ma X Y，Wang X C， Ngo H H， et al. Bioassay based luminescent bacteria： interferences， improvements， and applications[J]. Science of the Total Environment， 2014， 468-469（Complete）：1-11.

[3]錢驍，劉瑞志， 雷坤，等. 等毒性配比法研究甲醛與重金屬的聯合毒性效應[J].環境污染與防治， 2014（5）.

[4]楊亞琴，賈秀英.Cu2+、Zn2+和Cd2+對蟾蜍蝌蚪的聯合毒性[J].應用與環境生物學報，2006，12（3）：356-359.

作者簡介

李雪飛（1993-），男，漢族，湖北咸寧，研究生在讀，學士，武漢理工大學，主要研究方向：水處理。