葉黃素對頸動脈粥樣硬化斑塊炎性反應程度的影響

劉 洋，陳明駿，宋 翔，劉宏斌,*

葉黃素是屬于類胡蘿卜素中葉黃素類物質的一種萜類化合物，廣泛存在于日常食用的果蔬中。大量研究表明葉黃素在預防心腦血管疾病上起到重要的作用[1-4]。由于葉黃素在植物中廣泛存在、提取方便、安全無毒，研究開發含有葉黃素的保健食品已成為食品加工產業研究的熱點。動脈粥樣硬化是導致心腦血管疾病的重要原因[5-6]。相較于斑塊的大小以及其引發相應血管狹窄的程度，由于斑塊內炎性反應程度的增加而導致的斑塊不穩定性在引發心血管事件上具有更加重要的作用[7-8]。但富含葉黃素的食品是否能通過抑制斑塊炎性反應程度從而降低心腦血管事件的發生率尚不明確。葉黃素是具有較強抗炎、抗氧化能力的物質[9]。有研究也明確證實葉黃素的干預可以使動脈粥樣硬化患者血清中炎性因子的含量明顯減少[10]。前期通過回顧性分析證實了體內抗炎物質與斑塊炎性反應程度之間的相關性[11]。因此推測食用富含葉黃素的食品可以對動脈粥樣硬化斑塊的炎性反應起到一定的抑制作用，從而減少心腦血管事件的發生。本實驗中，通過正電子發射斷層顯像（positron emission tomography-computed tomography，PET-CT）技術對頸動脈斑塊進行定量分析，觀察口服葉黃素對其炎性反應程度的影響作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葉黃素 美國Sigma公司；C反應蛋白（C reactive protein，CRP）及白介素6（interleukin-6，IL-6）的酶聯免疫吸附反應試劑盒 美國R&D公司；膠囊的分裝在北京宇光生物科技有限公司進行。

1.2 儀器與設備

Sequoia512型彩色超聲診斷儀、Biograph Truepoint PET-CT 德國西門子公司；HEM-7121型血壓計日本歐姆龍公司；7060型全自動生化分析儀 日本日立公司；Couter LH750型全自動血常規分析儀 美國貝克曼公司；HP 1100型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國惠普公司。

1.3 方法

1.3.1 研究對象

連續納入2016年3月1日至2016年6月30日于解放軍總醫院心血管內科、神經內科就診的動脈粥樣硬化患者169 名。納入標準：頸動脈超聲提示頸動脈內膜中層厚度（intima-media thickness，IMT）不小于2 mm；患者及家屬對實驗內容知情同意。排除標準：行PET-CT檢查時合并急性感染；不能行PET-CT檢查者；血清葡萄糖濃度大于11.1 nmol/L。

1.3.2 各項指標的檢測

身高、體質量的檢測于晨起空腹時進行，并根據身高、體質量計算體質量指數（body mass index，BMI）。血壓的測量使用電子血壓計，待患者休息20 min后，取坐位在患者左臂進行，連續測3 次取平均值。吸煙史、藥物服用情況通過病史詢問得到。高血壓及糖尿病的診斷分別參照《中國高血壓防治指南2010》[12]、《中國2型糖尿病防治指南（2013版）》[13]。

血液樣本的采集在禁食12 h后進行，抽取12～20 mL靜脈血標本，部分提取血清后，使用全自動生化分析儀測定總甘油三酯（total triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、肌酐、轉氨酶水平。剩余部分置于EDTA抗凝管中，使用全自動血常規分析儀分析全血紅細胞、白細胞、性粒細胞、淋巴細胞、血小板以及血紅蛋白水平。另外剩余部分血液離心提取血清保存于-70 ℃冰箱中，以備進行炎性因子濃度的檢測。體內炎性因子的檢測通過酶聯反應的方法進行。本實驗中對臨床上常用的炎性指標CRP、IL-6的質量濃度進行檢測，操作按照相應試劑盒的要求進行。

血清中葉黃素的濃度通過HPLC測量，具體方法參照既往實驗[4,14]。首先將500 μL血清、500 μL內參液以及500 μL的甲醇滴定到5 mL的一次性試管，振蕩1 min。然后將700 μL正乙烷加入并再次振蕩2 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液。從正乙烷加入步驟開始，重復3 次，充分提取血清中的物質。將得到的上清液物質置于4 ℃環境下使用氮氣充分蒸發至1 mL，將剩余物使用流動相A（甲醇-乙腈，40∶60，V/V）溶解，加入HPLC柱中。HPLC條件：流速1.0 mL/min；檢測波長475 nm；PDA光譜收集范圍260～600 nm；進樣量20 μL。通過測定HPLC圖中的峰面積，再根據已知的標準量進行校正，得到相應藥物的濃度。

頸動脈粥樣硬化斑塊超聲檢查使用高分辨B型超聲[15]。患者采取臥位進行檢查，每一個斑塊的判讀需3 名有經驗的且各自獨立的超聲科醫生完成，記錄患者頸動脈IMT。當3 名醫生記錄的數據變異系數小于3%時，數據被認為有效。

圖1 一位診斷為頸動脈粥樣硬化斑塊的60 歲老年男性患者的頸部橫斷面影像示意圖Fig. 1 Cross-sectional image of the carotid artery of a 60-year-old male patient diagnosed with carotid atherosclerotic plaque

動脈粥樣硬化斑塊炎性程度的測定參照既往方法進行[16-17]：患者禁食6～8 h，靜脈注射18氟-脫氧葡萄糖（18F-fluorodeoxyglucose，18F-FDG），劑量為5 MBq/kg。待休息90 min后使用PET掃描儀進行頸部掃描。初步獲取圖像后，再次行低劑量CT掃描，獲取3D圖像。低劑量CT的參數為100 mA·s、120 kV，螺距0.9，層厚1 mm。圖像獲取后使用Mediex工作站進行圖像融合。將感興趣區域（region of interest，ROI）控制在直徑8 mm左右，如圖1所示。使用ROI區域中最大的像素值計算18F-FDG標準化攝取值（standardized uptake value，SUV）。最后按下式計算SUV標準化值（target to background ratio，TBR）。

每位患者的斑塊炎性程度評價指標TBR為自頸動脈分叉起4 mm內連續10 個層面TBR值的平均值。

1.3.3 實驗設計

將入選患者隨機分成4 組，分別為安慰劑組（淀粉膠囊，1 次/日）、低劑量組（葉黃素20 mg，1 次/日）、中劑量組（葉黃素40 mg，1 次/日）、高劑量組（葉黃素60 mg，1 次/日）。每名患者于確定參加實驗的1 周內行血液樣本采集以及PET-CT檢查。膠囊的服用時間均為午飯后20 min，并于每次服藥后做服藥記錄。實驗人員每3 個月電話回訪，確定服藥情況。服藥期為12 個月，于服藥結束后再次行血液標本采集及PET-CT檢查。對每名患者實驗開始及實驗結束的兩次血液學標本均進行血常規、血生化、炎性因子及藥物濃度方面的檢測。

1.4 數據統計分析

采用SPSS 19.0統計軟件進行處理。計量資料以 ±s表示，計數資料以百分數表示。兩組獨立樣本計量資料的比較采用t檢驗或非參數Wilcoxon秩檢驗，檢驗率的比較采用χ2檢驗。多組間比較采用單因素方差分析（Oneway ANOVA）方法，P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 各組患者服藥前后的基線資料Table 1 Baseline characteristics of patients from different groups

2 結果與分析

2.1 研究對象基線資料比較

符合納入條件且簽署知情同意書的患者169 名，隨機分入各組，后因失訪、未按時服藥等原因剔除26 人，共143 名患者完成實驗，其中安慰劑組34 名，低、中、高劑量組各34、38、37 名。

由表1可知，除炎性因子CRP及IL-6質量濃度降低外（P＜0.05），各組患者葉黃素干預前后基線數據均無明顯差異。葉黃素干預后，患者的肌酐、轉氨酶等指標水平未見升高，且在服藥期間納入患者未訴腹脹、腹痛、惡心嘔吐等情況，說明患者對葉黃素耐受性良好，且葉黃素對肝腎功能的損傷相對較小，尤其是在中、高劑量組。既往實驗中，口服葉黃素的劑量多集中在每天20 mg左右[4,10,14,18-19]，本次實驗在中高劑量組口服劑量提高，但通過結果分析發現，增加葉黃素的口服劑量至每天60 mg也并未發現因無法耐受而暫停或者降低葉黃素劑量的現象。

2.2 葉黃素干預后葉黃素血藥濃度的變化情況

表2 各組患者服藥前后葉黃素血藥濃度的變化情況Table 2 Effect of oral lutein on its concentration in blood

如表2所示，非安慰劑組患者服藥前后血藥濃度均發生了具有統計學意義的改變，且各組之間的葉黃素血藥濃度因為服藥劑量的不同產生了統計學差異。回顧既往實驗可以發現，每天20 mg的葉黃素攝入12 個月后，其血藥濃度多維持在1.92～2.20 μmol/L[4,10,14,18-19]，與本次實驗中、低劑量組基本相符，說明此次實驗干預藥物有效。通過組間的比較，可以發現低、中、高劑量3 組葉黃素干預后的血藥濃度依次升高。這說明每天40 mg及

60 mg的葉黃素攝入量在沒有發生耐受性問題的基礎上，因為口服劑量的增加達到了增加血藥濃度的目的。

2.3 葉黃素干預對頸動脈粥樣硬化斑塊的影響

表3 各組患者服藥前后頸動脈粥樣硬化斑塊IMT的變化情況Table 3 Effect of oral lutein on the IMT of carotid artery

各組患者服藥前后IMT改變如表3所示。與既往研究不同，各干預組雖然可見到干預后IMT減少的趨勢，但減少程度并未構成統計學意義[19]。分析原因，可能由于動脈粥樣硬化系慢性疾病，IMT的改變相對較慢，本實驗持續時間有限，尚未引起具有統計學意義上的改變。

表4 各組患者服藥前后頸動脈粥樣硬化斑塊炎性程度的變化情況Table 4 Effect of oral lutein on inflammation in carotid artery plaques

各組患者服藥前后頸動脈粥樣硬化斑塊炎性程度改變如表4所示。既往通過相關性分析業已證實，頸動脈TBR數值與頸動脈斑塊內巨噬細胞的數量呈現顯著的正相關關系，頸動脈TBR值成為通過無創學技術監測頸動脈斑塊炎性反應程度的準確指標，已經在臨床及科研中開始應用[16-17,20-21]。本次實驗的結果顯示葉黃素干預組TBR較安慰劑組發生了顯著的降低，而且在3 種劑量的干預組間可以發現，干預劑量越大，TBR的降低越明顯。說明在本次實驗中，葉黃素的干預可以使頸動脈斑塊的炎性反應程度降低，而且在所使用的3 種干預劑量中，劑量越大，斑塊炎性反應程度降低的水平越大。

3 討 論

既往有不少研究已證實服用富含葉黃素的食品與動脈粥樣硬化病變之間具有一定的關系。如在洛杉磯動脈粥樣硬化研究中報道，高葉黃素濃度（0.42 μmol/L）的患者較低葉黃素組（0.15 μmol/L）主動脈壁厚度減少80%[22]。動脈粥樣硬化社區風險研究（the atherosclerosis risk in communities，ARIC）中同樣發現高葉黃素飲食可以使動脈粥樣硬化患者在主要心腦血管事件上獲益[23]。但對于動脈粥樣硬化病變的觀察多集中通過冠脈造影、CT成像以及超聲得到的形態學結果[4,18-19]。急性冠脈綜合征主要由斑塊不穩定造成的斑塊破裂所致。斑塊炎性反應程度的增加導致內皮細胞紊亂，誘導平滑肌細胞凋亡，使斑塊內基質合成減少，降解增加，從而導致脂質池擴大，纖維帽變薄。穩定的硬斑塊因此逐步轉變成為不穩定的軟斑塊[24]。斑塊的炎性反應程度增加是造成斑塊穩定性惡化的重要原因[7]。現階段，從食品學角度防止動脈粥樣硬化的發生發展，還停留在從降低血脂水平的角度來進行，并非直接作用于更易引發急性心腦血管事件的斑塊炎性上。目前為止，并未有食品被證實可以有效降低動脈粥樣硬化斑塊的炎性反應程度。本實驗中，作為日常食品中大量存在且已經作為保健食品重要補充物的葉黃素，將斑塊的炎性反應程度作為作用靶點，被證實可以有效地抑制其炎性反應程度。另一方面，目前常用的降脂藥物，例如他汀類藥物，會引起肝功能損傷、橫紋肌溶解等嚴重副作用，尤其對亞裔人群[25-26]。葉黃素大量存在于日常食用的果蔬中，安全性上有明顯的優勢[27]。在本次實驗中，納入患者在12 個月的服用過程中，未出現因為藥物耐受的問題而終止實驗的情況。但在藥物副作用及安全性方面還需要更大型的臨床研究予以證實。

對于葉黃素引起斑塊炎性程度下降的原因，本實驗對患者服藥前后血清炎性因子的濃度進行了分析。結果發現以CRP、IL-6為標記物的系統炎性，其反應程度發生了顯著的下降。既往有實驗證實富含葉黃素的食物有降低機體系統炎性的作用，因而將富含葉黃素的天然食物歸結到抗炎食物中[10]。根據CRP及IL-6反映出的干預后炎性反應程度的下降，有理由推斷葉黃素對斑塊炎性的抑制作用與降低機體系統炎性有關。本實驗中對患者頸動脈斑塊體積的大小使用IMT作為衡量指標進行了測量，發現了干預后IMT存在減少的趨勢。通過抑制斑塊內脂質堆積，也可能是促使斑塊炎性減輕的原因之一。但后續需要持續時間更長的前瞻性研究予以進一步研究。

近年來越來越多的研究發現水果和蔬菜的攝入量與心腦血管疾病的發生率呈現負相關[1-2]。許多水果和蔬菜中富含的類胡蘿卜素被證實在心血管系統的保護中起到重要的作用[3-4]。在類胡蘿卜素中，番茄紅素、玉米黃素等類胡蘿卜素的抗炎抗氧化作用同樣也已被證實，因此推測番茄紅素及玉米黃素的攝入同樣可以對斑塊的炎性程度降低提供一定的幫助[28-29]。另外，前期有研究證實，葉黃素及番茄紅素在抗炎抗氧化方面具有顯著的協同作用[30]，據此，兩者的聯合應用可能會對動脈粥樣硬化斑塊的炎性反應程度起到更加有效的作用。

本實驗也有自身的一些不足。首先缺乏絕對的空白對照組。因為在正常的飲食中許多水果和蔬菜富含葉黃素。2009年美國農業部一項調查顯示，每人每天的葉黃素平均攝入量約為1.29 mg。因此在空白組的患者每日也可能攝入一定量的葉黃素[31]。另外，12 個月的實驗持續時間在研究葉黃素對動脈粥樣硬化斑塊的遠期影響上或許有不足。今后可以通過延長實驗的持續時間，從遠期臨床效果的影響上更完善地觀察增加食品中葉黃素的含量對動脈粥樣硬化斑塊的影響。

4 結 論

本研究通過不同劑量的葉黃素干預頸動脈粥樣硬化患者，結合PET-CT對斑塊炎性程度進行在體水平的定量分析，探討了葉黃素的食用與動脈粥樣硬化斑塊炎性程度之間的關系。通過此次實驗得出了增加葉黃素的服用可以有效地降低頸部粥樣硬化斑塊的炎性程度的結論。此結論為通過食品營養學措施預防心腦血管事件發生提供了新的思路，也為富含葉黃素的保健食品的推廣提供了新的實驗依據。

參考文獻：

[1] DAUCHET L, AMOUYEL P, HERCBERG S, et al. Fruit and vegetable consumption and risk of coronary heart disease: a metaanalysis of cohort studies[J]. Journal of Nutrition, 2006, 136(10):2588-2593.

[2] MARTINEZ-GONZALEZ M A, DE LA FUENTE-ARRILLAGA C, LOPEZ-DEL-BURGO C, et al. Low consumption of fruit and vegetables and risk of chronic disease: a review of the epidemiological evidence and temporal trends among Spanish graduates[J]. Public Health Nutrition, 2011, 14(12A): 2309-2315. DOI:10.1017/S1368980011002564.

[3] AGARWAL M, PARAMESWARI R P, VASANTHI H R, et al.Dynamic action of carotenoids in cardioprotection and maintenance of cardiac health[J]. Molecules, 2012, 17(4): 4755-4769. DOI:10.3390/molecules17044755.

[4] ZOU Z Y, XU X R, HUANG Y M, et al. High serum level of lutein may be protective against early atherosclerosis: the Beijing atherosclerosis study[J]. Atherosclerosis, 2011, 219(2): 789-793.DOI:10.1016/j.atherosclerosis.2011.08.006.

[5] LOZANO R, NAGHAVI M, FOREMAN K, et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the global burden of disease study 2010[J]. Lancet, 2012, 380: 2095-2128. DOI:10.1016/S0140-6736(12)61728-0.

[6] GISTERA A, HANSSON G K. The immunology of atherosclerosis[J].Nature Reviews Nephrology, 2017, 13(6): 368-380. DOI:10.1038/nrneph.2017.51.

[7] LIBBY P. Inflammation in atherosclerosis[J]. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology, 2012, 32(9): 2045-2051.DOI:10.1161/ATVBAHA.108.179705.

[8] KELLY P J, MURPHY S, COVENEY S, et al. Anti-inflammatory approaches to ischaemic stroke prevention[J]. Journal of Neurology Neurosurgery and Psychiatry, 2017, 88(12): 1-8. DOI:10.1136/jnnp-2016-314817.

[9] KARPPI J, NURMI T, KURL S, et al. Lycopene, lutein and beta-carotene as determinants of LDL conjugated dienes in serum[J]. Atherosclerosis, 2010, 209(2): 565-572. DOI:10.1016/j.atherosclerosis.2009.10.007.

[10] XU X R, ZOU Z Y, XIAO X, et al. Effects of lutein supplement on serum inflammatory cytokines, ApoE and lipid profiles in early atherosclerosis population[J]. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis, 2013, 20(2): 170-177. DOI:10.5551/jat.14365.

[11] 劉洋 劉宏斌 梁長在, 等. 頸動脈粥樣硬化斑塊炎性反應程度與血清膽紅素水平的相關性研究[J]. 中華老年心腦血管病雜志, 2015,17(3): 280-282. DOI:10.3969/j.issn.1009-0126.2015.03016.

[12] 中國高血壓防治指南修訂委員會. 中國高血壓防治指南2010[J].中華心血管病雜志, 2011, 39(7): 579-616. DOI:10.3760/cma.j.issn.0253-3758.2011.07.002.

[13] 中華醫學會糖尿病學分會. 中國2型糖尿病防治指南(2013版)[J].中華內分泌代謝雜志, 2014, 30(10): 893-942. DOI:10.3760/cma.j.issn.1000-6699.2014.10.020.

[14] SHE C, SHANG F, ZHOU K, et al. Serum carotenoids and risks of diabetes and diabetic retinopathy in a Chinese population sample[J].Current Molecular Medicine, 2017, 17(4): 287-297. DOI:10.2174/156 6524017666171106112131.

[15] CENTURION O A. Carotid intima-media thickness as a cardiovascular risk factor and imaging pathway of atherosclerosis[J].Critical Pathways in Cardiology, 2016, 15(4): 152-160. DOI:10.1097/HPC.0000000000000087.

[16] ALI A, TAWAKOL A. FDG PET/CT imaging of carotid atherosclerosis[J]. Neuroimaging Clinics of North America, 2016,26(1): 45-54. DOI:10.1016/j.nic.2015.09.004.

[17] FIFER K M, QADIR S, SUBRAMANIAN S, et al. Positron emission tomography measurement of periodontal18F-fluorodeoxyglucose uptake is associated with histologically determined carotid plaque inflammation[J]. Journal of the American College of Cardiology,2011, 57(8): 971-976. DOI:10.1016/j.jacc.2010.09.056.

[18] CHUNG R W S, LEANDERSON P, LUNDBERG A K, et al. Lutein exerts anti-inflammatory effects in patients with coronary artery disease[J]. Atherosclerosis, 2017, 262(7): 87-93. DOI:10.1016/j.atherosclerosis.2017.05.008.

[19] ZOU Z Y, XU X R, LIN X M, et al. Effects of lutein and lycopene on carotid intima-media thickness in Chinese subjects with subclinical atherosclerosis: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial[J].British Journal of Nutrition, 2014, 111(3): 474-480. DOI:10.1017/S0007114513002730.

[20] AMMIRATI E, MORONI F, PEDROTTI P, et al. Non-invasive imaging of vascular inflammation[J]. Frontiers in Immunology, 2014,5: 399. DOI:10.3389/fimmu.2014.00399.

[21] VOO S, KWEE R M, SLUIMER J C, et al. Imaging intraplaque inflammation in carotid atherosclerosis with18F-fluorocholine positron emission tomography-computed tomography: prospective study on vulnerable atheroma with immunohistochemical validation[J].Circulation: Cardiovascular Imaging, 2016, 9(5): 1-8. DOI:10.1161/CIRCIMAGING.115.004467.

[22] DWYER J H, NAVAB M, DWYER K M, et al. Oxygenated carotenoid lutein and progression of early atherosclerosis: the Los Angeles atherosclerosis study[J]. Circulation, 2001, 103(24):2922-2927. DOI:10.1161/01.CIR.103.24.2922.

[23] KRITCHEVSKY S B, SHIMAKAWA T, TELL G S, et al. Dietary antioxidants and carotid artery wall thickness. the ARIC study.atherosclerosis risk in communities study[J]. Circulation, 1995, 92(8):2142-2150. DOI:10.1161/01.CIR.92.8.2142.

[24] MARNANE M, PRENDEVILLE S, MCDONNELL C, et al. Plaque inflammation and unstable morphology are associated with early stroke recurrence in symptomatic carotid stenosis[J]. Stroke, 2014,45(3): 801-806. DOI:10.1161/STROKEAHA.113.003657.

[25] KAZI D S, PENKO J M, BIBBINS-DOMINGO K. Statins for primary prevention of cardiovascular disease: review of evidence and recommendations for clinical practice[J]. Medical Clinics of North America, 2017, 101(4): 689-699. DOI:10.1016/j.mcna.2017.03.001.

[26] DIAMANTIS E, KYRIAKOS G, QUILES-SANCHEZ L V, et al.The anti-inflammatory effects of statins on coronary artery disease: an updated review of the literature[J]. Current Cardiology Reviews, 2017,13(3): 209-216. DOI:10.2174/1573403X13666170426104611.

[27] GRANADO F, OLMEDILLA B, BLANCO I. Nutritional and clinical relevance of lutein in human health[J]. British Journal of Nutrition,2003, 90(3): 487-502. DOI:10.1079/BJN2003927.

[28] GIORDANO P, SCICCHITANO P, LOCOROTONDO M, et al.Carotenoids and cardiovascular risk[J]. Current Pharmaceutical Design,2012, 18(34): 5577-5589. DOI:10.2174/138161212803307527.

[29] COSTA-RODRIGUES J, PINHO O, MONTEIRO P R R. Can lycopene be considered an effective protection against cardiovascular disease?[J]. Food Chemistry, 2018, 245: 1148-1153. DOI:10.1016/j.foodchem.2017.11.055.

[30] STAHL W, JUNGHANS A, DE BOER B, et al. Carotenoid mixtures protect multilamellar liposomes against oxidative damage: synergistic effects of lycopene and lutein[J]. FEBS Letters, 1998, 427(2): 305-308.

[31] MCGUIRE S, RHODES D G, ADLER M E, et al. Consumption of pizza: what we eat in America, NHANES 2007－2010. food surveys research group dietary data brief No. 11. february 2014[J]. Advances in Nutrition, 2014, 5(4): 456. DOI:10.3945/an.114.006171.