泉州地區(qū)2014—2017年活禽相關(guān)外環(huán)境禽流感病毒監(jiān)測(cè)及遺傳進(jìn)化特征

鄭友限 劉建忠 李鋒平 陳志揚(yáng) 陳明春 吳小鳳

362000泉州市疾病預(yù)防控制中心

2013年以來我國(guó)多地相繼發(fā)現(xiàn)人感染H7N9禽流感病毒(avian influenza,AIV)病例,已經(jīng)造成多人死亡[1]。2014年1月以來泉州地區(qū)相繼出現(xiàn)了12例病例,死亡2例[2-3]。AIV屬于甲型流感病毒,主要感染禽和鳥類,至今發(fā)現(xiàn)能直接感染人類的主要有 H5、H7和 H9等亞型。目前,我國(guó)人感染H7N9禽流感呈現(xiàn)高度散發(fā),人感染禽流感主要是由于接觸感染病毒的禽鳥及其分泌物和排泄物。2016年10月,廣東、湖南等地又發(fā)現(xiàn)對(duì)禽高致病性病毒毒株[4]。為了解泉州地區(qū)外環(huán)境禽流感病毒的動(dòng)態(tài)分布狀況,本研究自2014年開始,對(duì)本地區(qū)活禽養(yǎng)殖場(chǎng)、活禽交易和宰殺市場(chǎng)、農(nóng)貿(mào)交易市場(chǎng)以及野生禽鳥棲息地等外環(huán)境標(biāo)本進(jìn)行監(jiān)測(cè),全面了解外環(huán)境中H5、H7和H9等亞型禽流感病毒分布情況,并從分子水平分析其基因特征和遺傳變異特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象2014—2017年泉州地區(qū)的12個(gè)縣(市、區(qū)),于每月定期開展一次監(jiān)測(cè),采用隨機(jī)抽樣的方法選擇活禽批發(fā)市場(chǎng)、家禽屠宰加工點(diǎn)、家禽規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)(戶)以及野生禽鳥棲息地等場(chǎng)所作為外環(huán)境監(jiān)測(cè)點(diǎn)。采集禽類飲水、糞便、籠具表面拭子、清洗禽類污水、宰殺或擺放禽肉案板表面拭子以及野生禽鳥棲息地的糞便等標(biāo)本共1 289份。在發(fā)生人禽流感疫情期間,則在疫點(diǎn)開展應(yīng)急監(jiān)測(cè),相應(yīng)擴(kuò)大監(jiān)測(cè)點(diǎn),增加標(biāo)本采樣量。

1.2 病毒核酸提取標(biāo)本采集完成后,4℃保存送至泉州市疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室,采用江蘇碩世生物科技有限公司的病毒核酸提取試劑盒(磁珠法),用全自動(dòng)核酸提取儀SSNP-2000 A對(duì)采集的標(biāo)本進(jìn)行病毒RNA提取,具體操作參照試劑盒和儀器使用說明書。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(Real-Time RTPCR)檢測(cè)甲型流感病毒及H5、H9和H7N9的檢測(cè)均采用深圳生科原生物技術(shù)有限公司的相應(yīng)產(chǎn)品進(jìn)行,具體操作參照產(chǎn)品說明書。檢測(cè)儀器為L(zhǎng)ightCycler 480 II實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.4 H7N9禽流感病毒序列測(cè)定與同源性分析

選擇Real-Time RT-PCR檢測(cè)為H7N9陽性的樣本,利用Promega公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及流感病毒通用引物uni12(agcaaaagcagg)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的片段特異性引物和TaKaRa公司的Pyrobest DNA Polymerase進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用QIAquick Gel Extraction Kit膠回收試劑盒回收后送上海生工公司測(cè)序。測(cè)序產(chǎn)物的拼接采用DNAstar Lasergene7.1軟件,先用MEGA7.0軟件的Clustal W法進(jìn)行序列比對(duì),再采用Neighbor-Joining法分別構(gòu)建HA和NA基因的進(jìn)化樹。本研究中其他人源、禽源H7N9禽流感病毒基因參考序列均來源于GeneBank和GISAID。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,率的比較采用卡方檢驗(yàn),P值小于0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2014—2017年外環(huán)境標(biāo)本監(jiān)測(cè)情況2014—2017年共采集1 289份外環(huán)境標(biāo)本,檢出377份甲型流感病毒核酸陽性(377/1 289),其中172份H7N9核酸陽性,49份H5核酸陽性,155份H9核酸陽性,1份未能分型。各年度H7N9亞型陽性率差別較大,其中最高的為2017年的21.88%,其次為2015年的18.45%,2014年和2016年則相對(duì)較低,分別為7.56%和7.28%,見表1。

2.2 不同場(chǎng)所不同類型標(biāo)本H7N9禽流感病毒監(jiān)測(cè)情況來自4種不同涉禽監(jiān)測(cè)場(chǎng)所標(biāo)本中,活禽交易和宰殺市場(chǎng)H7N9禽流感病毒陽性標(biāo)本數(shù)最多(141份),陽性率最高(16.95%),其次為農(nóng)貿(mào)市場(chǎng),陽性標(biāo)本17份,陽性率為16.50%,而禽類養(yǎng)殖場(chǎng)所則相對(duì)較少(陽性標(biāo)本14份,陽性率為4.40%),野生候鳥棲息地則未檢出H7N9亞型禽流感病毒。在任何監(jiān)測(cè)場(chǎng)所,清洗禽類污水標(biāo)本,陽性率最高為19.12%(52/272),其次為籠具表面擦拭標(biāo)本H7N9禽流感病毒陽性率為14.58%(42/288),宰殺或擺放禽肉案板表面的擦拭標(biāo)本以及糞便標(biāo)本的 H7N9禽流感病毒陽性率,分別為12.10%(34/281)和10.16%(39/384),禽類飲水的H7N9禽流感病毒陽性率則相對(duì)較低,為7.69%(5/65),見表 2。

表1 2014—2017年泉州地區(qū)外環(huán)境標(biāo)本禽流感病毒檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Detection results of H7N9 avian influenza virus in environment samples in Quanzhou during 2014-2017

表2 不同場(chǎng)所不同類型標(biāo)本H7N9禽流感病毒檢測(cè)情況比較Tab.2 Comparison of detection of H7N9 avian influenza virus in different places and different types of samples

2.3 H7N9禽流感病毒基因同源性與病毒毒力分析通過PCR擴(kuò)增和測(cè)序分析,本研究獲得了福建省泉州地區(qū)4株H7N9病毒的HA和NA基因全長(zhǎng),分別來自外環(huán)境標(biāo)本QZ1613、QZ1708和人感染H7N9禽流感病毒患者標(biāo)本QZ10、QZ11。進(jìn)化分析結(jié)果顯示,2株人源H7N9病毒的HA和NA基因都屬于長(zhǎng)江三角洲譜系,而2株環(huán)境樣本來源的H7N9病毒的HA和NA基因都屬于珠江三角洲譜系,見圖1。對(duì)該4株H7N9病毒的HA、NA和PB2蛋白的關(guān)鍵位點(diǎn)的分析結(jié)果顯示,這4株病毒HA蛋白的裂解位點(diǎn)均為PKGR/G,沒有發(fā)生高致病性突變,屬于低致病性H7N9禽流感病毒；NA蛋白292位(N2編號(hào))氨基酸都為R,沒有出現(xiàn)奧司他韋耐藥突變；PB2蛋白中,627位氨基酸從E突變?yōu)榱薑,526位和701位氨基酸沒有出現(xiàn)突變。

3 討論

本研究對(duì)福建省泉州地區(qū)2014—2017年活禽相關(guān)外環(huán)境禽流感毒監(jiān)測(cè)情況及遺傳進(jìn)化特性進(jìn)行了分析比較。結(jié)果顯示泉州地區(qū)活禽相關(guān)外環(huán)境中禽流感病毒污染較為嚴(yán)重,尤其是H7N9禽流感病毒,陽性率為 13.34%,其中以 2017年為最高(21.88%),污染率高的場(chǎng)所主要為家禽宰殺加工場(chǎng)所、活禽交易市場(chǎng),而野生候鳥棲息地未檢出H7N9,表明泉州地區(qū)活禽相關(guān)外環(huán)境是人感染H7N9病毒的高危場(chǎng)所,應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)測(cè)。外環(huán)境標(biāo)本檢出率由高到低依次為清洗禽類的污水、籠具表面擦拭標(biāo)本、宰殺或擺放禽肉的擦拭標(biāo)本、糞便標(biāo)本、禽類飲用水,清洗禽類的污水和宰殺或擺放禽肉的案板表面的H7N9禽流感病毒檢出率相對(duì)較高,而糞便標(biāo)本和禽類飲水的檢出率則相對(duì)較低,表明在禽類銷售、宰殺等環(huán)節(jié)中極易造成環(huán)境污染,尤其是宰殺環(huán)節(jié)中所用的水和案板等更容易被禽流感病毒污染,主要原因可能與不同類型標(biāo)本受禽類交叉污染的嚴(yán)重程度不同有關(guān)[5]。對(duì)其中4株病毒的HA和NA基因序列進(jìn)化分析,結(jié)果顯示2株人源和2株環(huán)境樣本來源H7N9病毒的HA和NA基因分別屬于長(zhǎng)江三角洲譜系和珠江三角洲譜系。盡管這4株病毒都是第5次疫情期間分離,但是在遺傳進(jìn)化上差別較大,提示這2個(gè)病例感染的病毒跟這兩個(gè)環(huán)境樣本中的病毒并沒有直接聯(lián)系。同時(shí),這4株H7N9病毒毒株對(duì)禽類來說都是低致病性,NA蛋白都沒有出現(xiàn)耐藥突變,仍對(duì)奧司他韋敏感,但PB2蛋白都出現(xiàn)了與毒力相關(guān)的E627 K突變。

注：紅色三角代表本研究的4株病毒序列圖1 泉州市4株H7N9病毒HA(A)和NA(B)核酸序列遺傳進(jìn)化分析Note：The red triangle represents the 4 virus sequences in the articleFig.1 A,Phylogenetic analysis of HA(A)and NA(B)gene

本地的活禽批發(fā)交易和屠宰市場(chǎng)的直接暴露可能是導(dǎo)致H7N9禽流感病毒感染的高危因素。因此接觸活禽或長(zhǎng)期暴露在活禽相關(guān)外環(huán)境下均有可能導(dǎo)致人感染H7N9禽流感[6],建議相關(guān)部門在疫情暴發(fā)期間,加強(qiáng)源頭防控,規(guī)范活禽市場(chǎng)管理其得病后風(fēng)險(xiǎn)極大應(yīng)推行“三個(gè)一”制度,做好活禽經(jīng)營(yíng)市場(chǎng)交易場(chǎng)所、設(shè)施和運(yùn)輸工具的全面消毒清潔,以及個(gè)人防護(hù)等工作才是控制禽流感的長(zhǎng)效措施[7]。每年9月到次年4月是人感染H7N9禽流感的高發(fā)期,應(yīng)在秋季全面推進(jìn)家禽H7N9疫苗免疫,進(jìn)一步降低H7N9禽流感傳播的風(fēng)險(xiǎn),保障人群的安全。同時(shí)積極開展外環(huán)境禽流感病毒監(jiān)測(cè),掌握外環(huán)境中H7N9禽流感病毒的分布和變異情況,為預(yù)測(cè)預(yù)警流感流行趨勢(shì),及時(shí)采取預(yù)防控制措施提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突無