苦豆子生物堿浸提物的抑菌性研究

余永婷，馮作山

（1.新疆輕工職業技術學院，新疆烏魯木齊 830021；2.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊 830052）

0 引言

苦豆子（Sophora alopecuraides L.）屬于豆科槐屬，又稱苦豆根、歐苦參、苦豆草、西豆根、苦甘草等[1]，西北區域為苦豆子主產區。其所含有效成分中包含較多生物堿，生物堿總量在全草、種子中的占比分別達6.11%～8.03%，8.11%，所含生物堿20多種，包括氧化槐堿、金雀花堿、氯化苦參堿、苦豆堿、槐定堿、苦參堿與槐果堿等[2]。基于我國傳統醫學觀點，苦豆子味苦性寒，具備解毒、利尿退黃、祛濕清熱等功效。通過對苦豆子進行現代藥理學研究，發現其所含藥物活性物質是苦參堿類，此生物堿具備諸多功效，如清熱燥濕、降血脂降壓、殺蟲、降溫鎮痛、抗病毒、抗潰瘍、抗炎、抗腹瀉與利尿等[3]。現今，在研究與應用苦豆子方面，全球都將生物堿作為重點。試驗對苦豆子生物堿抑菌性展開測定，對其抑菌效應進行觀察，研究此藥物生物堿的抑菌功能，可將研究結果作為理論依據供苦豆子在防腐、食品保鮮和醫藥價值研發所需。

1 材料與設備

1.1 材料

苦豆子來源于新疆，所用菌株由微生物實驗室提供。

細菌：大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcu saurers）、枯草芽胞桿菌（Bacillussubtilis）、普通變形桿菌（Proteus vulgaris）、痢疾志賀氏菌（Shigelladysenteriae）、四聯球菌（Micrococcus tetragenus）；酵母菌：釀酒酵母 （Saccharomyces cerevisiae）；霉菌：根霉（Rhizopus sp.）、毛霉（Mucor）/黑曲霉（Aspergillus sp.）。

培養基：察氏瓊脂/牛肉膏蛋白胨培養基、麥芽汁培養基。

1.2 儀器設備

電子天平、722型可見光分光光度儀、電熱恒溫水浴鍋、N-1001型系列EYELA旋轉蒸發儀、DZF-6090型真空干燥箱、DELTA320型pH計、恒溫培養箱、YXQ-SG-280型醫用殺菌鍋等。

2 試驗方法

2.1 提取苦豆子生物堿的浸提物和制劑的制備[4-5]

精準稱量0.1 kg苦豆子粉，在室溫下，由酸性乙醇溶劑對其浸泡4次，4 d/次。回收溶劑，接著進行真空干燥，獲得總浸提物，然后依次通過脫脂處理、酸化處理、堿化處理、氯仿萃取處理環節，獲得苦豆子生物堿提取物。精準稱量10 g苦豆子生物堿，放在燒杯內，滴加2 mL鹽酸溶液（10 mL/L）使其溶解，加蒸餾水至80 mL，加4 g活性炭，煮沸15 min，過濾澄清后濾液加蒸餾水至100 mL，調節pH值5～6，于100℃條件下滅菌30 min后備用。

2.2 苦豆子生物堿浸提物的抑菌試驗[6-7]

常用的濾紙片法測定苦豆子生物總堿的抑菌作用：借助打孔器，把定性濾紙制作為小圓片（φ9 mm），然后置于培養皿內，于高壓條件下實施滅菌處理。分別把經過滅菌的濾紙片置于下述3類溶液內進行浸泡：①0.1 mg/mL的苦豆子生物堿液；②無菌水；③0.1%的苯甲酸鈉溶液。均進行12 h充分浸泡。分別吸取各菌懸液100μL，于無菌環境中，放置在已預先制備的培養基平板內，在三角刮鏟協助下，做到均勻涂布。然后，借助經過滅菌處理的鑷子夾取已浸透的濾紙片貼于已接種的平板上，將培養皿背側劃分出3個部分（面積相等），將含苦豆子生物堿提取物濾紙片貼在其中一部分上，一部分則貼無菌水浸過的濾紙片作對照試驗，剩余部分貼含0.1%無菌苯甲酸鈉的濾紙片，2片濾紙需保持一定間距。然后，把此平板置于恒溫培養箱內進行培養，將酵母菌置于30±1℃培養箱內培養24 h；細菌培養時間18～24 h，溫度36±1℃；霉菌培養時間48 h，溫度28±1℃。對各抑菌圈直徑進行測量，為了獲得準確的檢測數據，各菌需安排3個重復。

2.3 苦豆子生物堿浸提物抑菌活性的影響[8]

2.3.1 pH值對苦豆子生物堿浸提物抑菌活性的影響

在無菌操作條件下，分別移取10 mL稀釋過的苦豆子生物堿液于7個無菌小燒杯中，在這些小燒杯內分別加入一定濃度的氫氧化鈉或鹽酸溶液，以此調節苦豆子生物堿提取液酸堿度，其中pH值最低為4.0，最高為10.0，二者之間的pH值還有5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，借助采取同以上濾紙片法一致操作，平行操作2次，求其平均值，比較不同的pH值對苦豆子生物堿提取液抑菌活性的影響。

2.3.2 溫度對苦豆子生物堿浸提物抑菌的影響

在無菌操作條件下，分別移取5 mL苦豆子生物堿提取液于5個無菌小燒杯中，把濾紙片分別放入25，76，100，121℃的水浴中加熱的燒杯中加熱2 h；接著采用以上濾紙片法一致操作，進行2次平行操作，以均值為準，針對溫度影響此提取液抑菌活性程度展開對比分析。

2.4 苦豆子生物堿浸提物對致病菌作用時間與抑菌率的關系[9]

分別測定不同濃度的苦豆子生物堿提取液對革蘭氏陽性菌的枯草芽孢桿菌和革蘭氏陰性菌的大腸桿菌作用時間與抑菌率之間的關系。在無菌操作條件下，分別用0.1 mL枯草芽孢桿菌和0.1 mL大腸桿菌懸液與2倍稀釋法稀釋好的苦豆子生物堿提取液1 mL充分混合，設定作用時間為1，3，6，9，12 h；吸取0.2 mL混合菌懸液移至無菌平皿內，再將固體培養基（溫度為60℃上下）倒入，徹底混勻，靜置凝固，然后倒置在培養箱內進行1 d培養，溫度為37℃。另外，在0.1 mL大腸桿菌懸液與0.1 mL枯草芽孢桿菌懸液內分別滴加0.2 mL無菌水，且分別混勻，將固體培養基倒入，將所制平板當做對照，置于培養箱中進行1 d培養，溫度37℃；對菌落數進行準確統計，采取以上濾紙片法，進行2次平行重復操作，同時通過公式（1），對抑菌率進行求解。

3 結果與分析

3.1 苦豆子生物堿浸提物的抑菌作用

苦豆子生物堿浸提物對試驗菌的抑制效果見表1。

表1 苦豆子生物堿浸提物對試驗菌的抑制效果（抑菌圈大小）/mm

由表1可知，苯甲酸鈉與苦豆子生物堿浸提物抑菌作用之相比，抑菌效果較差。苦豆子生物堿浸提物具備一定抑菌功能，包括細菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌與產氣腸桿菌。其中，后2種抑制作用更為突出。此次試驗所涉及菌種有3類，此浸提物可明顯抑制的為黑曲霉，抑制根霉與毛霉效果不明顯。

3.2 苦豆子生物堿浸提物抑菌活性的影響

3.2.1 不同溫度對苦豆子生物堿浸提物抑菌活性的影響

不同溫度對苦豆子生物堿浸提物抑菌活性的影響見表2。

由表2可知，在較高溫度下，苦豆子生物堿浸提物呈現出一定穩定性。在溫度提高后，抑菌能力隨之增強。導致此結果的原因可能為此浸提物在溫度提升下濃度變大，從而抑菌能力提升。

表2 不同溫度對苦豆子生物堿浸提物抑菌活性的影響

3.2.2 不同pH值對苦豆子生物堿浸提物抑菌活性的影響

不同pH值對苦豆子生物堿浸提物抑菌活性的影響見表3。

表3 不同pH值對苦豆子生物堿浸提物抑菌活性的影響

由表3可看出，當苦豆子生物堿所處環境pH值為8時，抑菌作用最突出。

3.3 苦豆子生物堿浸提物對致病菌作用時間與抑菌率的關系

不同質量濃度的苦豆子生物堿浸提物對大腸桿菌作用時間與抑菌率的關系見圖1，不同質量濃度的苦豆子生物堿浸提物對枯草芽孢桿菌作用時間與抑菌率的關系見圖2。

圖1 不同質量濃度的苦豆子生物堿浸提物對大腸桿菌作用時間與抑菌率的關系

由圖1和圖2可知，在同一質量濃度的苦豆子生物堿浸提物作用時間越長，其抑菌率也越高；而且相同時間內，苦豆子生物堿浸提物的質量濃度越高，抑菌率越高。就大腸桿菌與枯草芽孢桿菌而言，相比革蘭氏陰性菌，對革蘭氏陽性菌的抑制性更強。

4 結論

圖2 不同質量濃度的苦豆子生物堿浸提物對枯草芽孢桿菌作用時間與抑菌率的關系

通過此次抑菌試驗可知，苦豆子生物堿浸提物對細菌表現出一定的抑制效應，針對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、產氣腸桿菌、金黃色葡萄球菌，所對應的MIC值依次是12.50，5.25，5.25，25.00μg/mL。在此浸提物抑菌效果上，相比細菌，對酵母菌未表現出顯著抑制性，對應酵母菌的MIC值是25μg/mL，就試驗所涉及的3類菌種而言，可有效抑制黑曲霉，未見明顯抑制根霉與毛霉。

對于苦豆子生物堿浸提物抑菌效果而言，溫度越高，苦參堿的抑菌效果越顯著；在不同的pH值范圍內均較穩定，在弱堿性條件下（pH值8左右） 其抑菌作用較好；當作用時間既定時，抑菌效果隨著質量濃度的提升而愈加明顯；當質量濃度一定時，作用時間愈長，抑菌效果越明顯。通過對比此浸提物分別抑制枯草芽孢桿菌與大腸桿菌的表現可知，相比革蘭氏陰性菌，其抑制革蘭氏陽性菌的作用較強。

參考文獻：

[1]江蘇新醫學院.中藥大辭典 [M].上海：上海科技出版社，1997：1 293-1 294.

[2]張蘭珍，李家實.苦豆子種子生物堿成分研究 [J].中國中藥雜志，1997，22（12）：740-743.

[3]熊鑫，郭樹奇，李琳.苦豆子生物堿對番茄生長及果實品質的影響 [J].中國農業科學，2015，48（9）：1 737-1 746.

[4]秦學功，元英進.苦豆子種子中生物堿的冷浸提取試驗研究 [J].中草藥，2001，32（7）：604-606.

[5]趙輝，趙志剛.苦豆籽中總生物堿的含量測定 [J].化學研究與應用，2001，13（2）：211-212.

[6]魏玉西，帥莉，郭道森，等.辣椒堿的抑菌活性研究 [J].食品科學，2006，27（8）：76-78.

[7]濃萍，范秀容，李廣武.微生物學實驗 [M].北京：高等教育出版社，2015：75-80.

[8]邸大琳，李法慶，陳蕾，等.苦參體外抑菌作用的研究 [J].時珍國醫國藥，2006，10（17）：1 974-1 975.

[9]張義英，王俊儒，龔月樺，等.駱駝蓬醇提物抑菌活性的初步研究 [J].西北農林科技大學學報（自然科學版），2006，11（34）：122-125.◇