再生絲素蛋白溶液脫鹽新工藝及其應(yīng)用

李鵬飛， 鄧 樺， 馬 軍， 劉紅斌， 劉珍珠

(1. 天津工業(yè)大學(xué) 紡織學(xué)院， 天津 300387； 2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 衛(wèi)生裝備研究所， 天津 300161)

蠶絲主要由絲素蛋白和絲膠蛋白組成，其中絲素蛋白作為核心纖維占總質(zhì)量的75%左右，是提供蠶絲力學(xué)性能并且使蠶絲表現(xiàn)出多種優(yōu)點的主要成分[1]，正逐步應(yīng)用于化妝品、醫(yī)學(xué)[2]和生物等多個領(lǐng)域。天然絲素蛋白不溶于水，目前采用溶解—精制后再加以利用，對于絲素蛋白的溶解工藝已有大量報道，目前主要是采用CaCl2-EtOH-H2O三元體系來溶解絲素，絲素溶解后，由于高濃度鹽的存在使其無法被進一步利用，所以脫鹽是實現(xiàn)絲素蛋白在其應(yīng)用領(lǐng)域產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵問題之一。

近年來人們對絲素蛋白溶液脫鹽的方法進行不斷的研究改進，傳統(tǒng)上采用的是透析袋脫鹽[3]，該方法耗時長，耗水多。隨著膜分離技術(shù)的發(fā)展，有研究人員利用超濾、納濾和電滲析等技術(shù)[4-6]進行絲素蛋白溶液的脫鹽。雖然3種方法優(yōu)于透析袋脫鹽[7]，但是仍然存在著脫鹽效率低、脫鹽時間長，耗能嚴重等問題。

傳統(tǒng)脫鹽工藝的低效嚴重制約著絲素蛋白溶液的規(guī)模化使用，為了促進絲素蛋白溶液的工業(yè)化生產(chǎn)，本文探討并優(yōu)化一種絲素蛋白溶液(以下稱為料液)的新型脫鹽工藝，即擴散滲析-電滲析集成脫鹽工藝，并且將該工藝條件下制備的高純度的絲素蛋白溶液制成絲素蛋白粉，進一步探索該工藝所得產(chǎn)品的應(yīng)用性能。本文所涉及到的2種膜堆，其中擴散滲析膜堆利用擴散滲析膜兩側(cè)溶液的濃度差為推動力來實現(xiàn)脫鹽；電滲析膜堆則是在外加電場的作用下通過離子的定向遷移實現(xiàn)脫鹽。二者結(jié)合對絲素蛋白溶液進行脫鹽，既可充分利用絲素蛋白溶液本身的高鹽濃度，又可利用電場作用來提高脫鹽效率，從而達到既高效又節(jié)能的目的。

1 實驗部分

1.1 材料和儀器

材料：蠶絲(市購)，碳酸鈉、無水氯化鈣(塊)、無水乙醇、鹽酸、氯化銨、結(jié)晶硫酸鎂、無水硫酸鈉、氨水、鋅粒、乙二胺四乙二鈉鹽、絡(luò)黑T、無水乙醇，以上均為分析純。

儀器：TD系列電子天平；DHG-9055型A烘箱；D-8401型多功能攪拌器；電熱恒溫水浴鍋；YZ1515x型蠕動泵；85-2型恒溫磁力攪拌器；DDSJ-308F型電導(dǎo)率儀；CR22G型超速冷凍離心機；121 MB型氨基酸自動分析儀；TM-3030型臺式掃描電子顯微鏡。

擴散滲析模塊：外形尺寸為100 mm×200 mm，有效尺寸為70 mm×120 mm，厚度為0.5 mm，擴散滲析陽膜，膜對數(shù)量為10，流量范圍為20～40 L/h。

電滲析模塊：外形尺寸為100 mm×200 mm，有效尺寸為70 mm×120 mm，厚度為0.5 mm，均相陰陽離子交換膜，膜對數(shù)量為10，操作電壓5 V，流量范圍為20～40 L/h。

1.2 不溶性絲素蛋白粉制備工藝

生蠶絲經(jīng)脫膠、溶解，離心除雜后用擴散滲析-電滲析集成工藝脫鹽，得到純度較高的絲素蛋白溶液，將溶液中加入無水乙醇[8]，所得白色沉淀經(jīng)干燥后得到不溶性絲素蛋白粉。

1.2.1蠶絲脫膠與溶解

將蠶絲在溫度為100 ℃，浴比為1∶40條件下，用質(zhì)量濃度為5 g/L的Na2CO3溶液脫膠3次，每次30 min，除去絲膠蛋白，于50 ℃下烘干，得到脫膠蠶絲。按照物質(zhì)的量比1∶2∶8配制氯化鈣-乙醇-水(CaCl2-EtoH-H2O)三元體系溶液，以脫膠后蠶絲與三元體溶液質(zhì)量比為1∶15,在60 ℃恒溫水浴鍋中對脫膠后的蠶絲溶解4 h，溶解后，待絲素蛋白溶液冷卻至室溫后用離心機8 000 r/min，離心10 min，得到絲素蛋白溶液。

1.2.2絲素蛋白溶液脫鹽

取0.1 L所制備的絲素蛋白溶液，稀釋至一定濃度，配制成料液。準確量取1 L去離子水為滲透液(料液與滲透液體積比為1∶10)，然后將料液與滲透液分別以流量為40、20 L/h[9]通入擴散滲析模塊，進行第1階段預(yù)脫鹽。待脫鹽至一定脫鹽率時，設(shè)置電流為0.2 A[9]，料液和滲透液流量不變，進行第2階段電滲析脫鹽，至溶液電導(dǎo)率降至200 μS/cm，此時脫鹽結(jié)束。其中料液和滲透液均由蠕動泵循環(huán)供給。

1.2.3不溶性絲素蛋白粉制備

取一定體積的絲素蛋白溶液，調(diào)制至質(zhì)量分數(shù)為5%，在室溫下加入適量無水乙醇，溶液中會迅速產(chǎn)生白色沉淀，靜置至待沉淀不再產(chǎn)生時，過濾取沉淀，經(jīng)干燥后得到不溶性的絲素蛋白粉。

1.3 測定與計算方法

溶液總?cè)芙夤腆w(TDS)值通過臺式電導(dǎo)率儀進行測定。Ca2+含量采用EDTA滴定法[10]測定。計算公式為

N=T×V

β=(mi/mj)×100%

θ=(m1/m0)×100%

W=U×I×t

式中：N為實際離子總量，g；T為溶液TDS值，g/L；V為溶液的體積，L；β為脫鹽率，%；mi為滲透液中含鹽量，g；mj為脫鹽前料液中含鹽量，g；θ為絲素蛋白回收率，%；m1為脫鹽后料液中蛋白質(zhì)質(zhì)量，g；m0為脫鹽前料液中蛋白質(zhì)質(zhì)量，g；W為電滲析能耗(動力能耗除外)，kWh；U為操作電壓，V；I為操作電流，A；t為操作時間，h；η為料液體積增長率，%；V0為料液初始體積，L；Vn為nh時料液體積，L。

其中，脫鹽前料液中蛋白質(zhì)含量用溶解的絲素蛋白質(zhì)量來衡量，而脫鹽后蛋白質(zhì)含量用脫鹽后的料液經(jīng)干燥后所剩余固體質(zhì)量來衡量。

氨基酸含量測定：將絲素蛋白樣品放置于水解管中，加入適量的6 mol/L的HCl溶液，真空封口，在110 ℃下水解24 h，冷卻后定容、過濾、蒸干，再加入0.02 mol/L的HCl溶液，并在空氣中放置30 min，上機測定氨基酸含量。

利用TM-3030型臺式掃描電子顯微鏡觀察不溶性絲素蛋白粉的微觀形貌。

2 結(jié)果與討論

2.1 料液質(zhì)量分數(shù)的選擇

在使用CaCl2-EtOH-H2O三元體系溶解絲素蛋白過程中，Ca2+會配位在絲素蛋白大分子鏈的絡(luò)氨酸、絲氨酸的側(cè)鏈羥基處，形成螯合物[11]，這說明絲素蛋白溶液中Ca2+分為2部分：一部分是游離在溶液中的Ca2+，可對溶液的TDS值產(chǎn)生影響；另一部分由于與絲素蛋白螯合而沒有對溶液的TDS值產(chǎn)生影響。這2部分Ca2+會隨著溶液質(zhì)量分數(shù)的不同而產(chǎn)生變化。有研究者通過對絲素蛋白溶液質(zhì)量分數(shù)和TDS值關(guān)系的研究，發(fā)現(xiàn)隨著質(zhì)量分數(shù)的增加溶液TDS值先增大后減小且在3%時TDS值達到最大，再而考慮到水的反向滲透，最終選擇絲素蛋白溶液進液質(zhì)量分數(shù)為4%[12]，但是這個結(jié)果對料液體積的變化情況考慮的并不充分，如圖1所示。

圖1 料液體積增長百分率與時間的關(guān)系Fig.1 Relationship between percentage of volume growth and time

由圖1可知，在脫鹽過程中，由于水的反向滲透，料液體積逐漸增加且增長率可達到80%左右，料液體積稀釋的程度較大。可見僅考慮4%的質(zhì)量分數(shù)顯然是不夠的，因此選擇料液質(zhì)量分數(shù)為5%、4%和3%進行第1階段擴散滲析預(yù)脫鹽實驗，結(jié)果見圖2。

圖2 不同料液質(zhì)量分數(shù)下時間和脫鹽率的關(guān)系Fig.2 Relationship between concentration of liquid and time and desalination rate

由圖2可知，達到相同脫鹽率時料液質(zhì)量分數(shù)為5%的曲線用時最短，由圖中曲線的斜率可知3種質(zhì)量分數(shù)料液在0～4 h內(nèi)脫鹽效率較高。結(jié)合圖1可知，當(dāng)料液初始質(zhì)量分數(shù)為5%時，料液質(zhì)量分數(shù)將由5%降至2.8%左右，在此期間脫鹽效率逐漸提升然后再下降，而初始質(zhì)量分數(shù)為4%時，進行到1 h時料液質(zhì)量分數(shù)已被稀釋至3.0%左右，此后長時間內(nèi)脫鹽效率逐漸下降。

綜合考慮圖1和圖2，選定料液質(zhì)量分數(shù)5%為最佳，此時不僅濃度差推動力較大，而且最終得到的絲素蛋白溶液質(zhì)量分數(shù)也較大，不溶性絲素蛋白粉的產(chǎn)率也相應(yīng)較高。

2.2 擴散滲析預(yù)脫鹽率的選擇

隨著脫鹽過程的進行，料液中的CaCl2逐漸滲析至滲透液中，致使料液和滲透液的鹽的質(zhì)量分數(shù)差越來越小，脫鹽效率會逐漸降低，此時溶液體系會較長時間地處于料液鹽的質(zhì)量分數(shù)高于滲透液鹽濃度的狀態(tài)，而且隨著這段時間的延長，滲透液向料液中反向滲透的水會增加，這就會造成料液質(zhì)量分數(shù)逐漸減小，從而會減少不溶性絲素蛋白粉的產(chǎn)率，但是若過大的縮短擴散滲析預(yù)脫鹽時間，又會增加電滲析脫鹽時間，這樣會造成能耗增加；因此選定料液進液質(zhì)量分數(shù)為5%，分別進行擴散滲析和電滲析脫鹽實驗，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同脫鹽方式下時間和脫鹽率的關(guān)系Fig.3 Relationship between different desalination methods and desalting rate and time

由圖3可知，電滲析脫鹽所得到的是一條斜率基本不變的直線，而擴散滲析脫鹽所得到的是一條斜率逐漸減小的曲線，表明前者的脫鹽效率基本不受料液和滲透液之間濃度差的影響，而后者的脫鹽效率隨著料液和滲透液之間質(zhì)量分數(shù)差的減小而下降。相同時間內(nèi)，2種脫鹽方式在脫鹽率為60%左右差距變得越來越大。

選擇預(yù)脫鹽率分別為20%、40%、60%進行脫鹽實驗，結(jié)果如表1所示。

表1 不同預(yù)脫鹽率脫鹽實驗結(jié)果Tab.1 Experimental results of desalting at different pre-desalting rates

由表1可知，不同預(yù)脫鹽率對脫鹽時間和能耗的影響較大，對最后所得溶液的質(zhì)量分數(shù)影響較小。表中最終所得濃度比圖1的分析中所提到的質(zhì)量分數(shù)高，因為圖1、2的數(shù)據(jù)是擴散滲析預(yù)脫鹽階段的數(shù)據(jù)，在預(yù)脫鹽結(jié)束后要進行電滲析深度脫鹽，此時料液中鹽濃度要長時間處于低于滲透液中鹽質(zhì)量分數(shù)的狀態(tài)，料液中的水會透過交換膜向滲透液中轉(zhuǎn)移，因此會對料液達到初步濃縮的效果，且會隨著電滲析脫鹽時間的延長濃縮效果更加明顯。

當(dāng)預(yù)脫鹽率為60%時，雖然能耗相對來說比較低，但是最終脫鹽時間和料液質(zhì)量分數(shù)是最不理想的；當(dāng)預(yù)脫鹽率為40%時，雖然脫鹽時間比20%時長，但是此時能耗較小，而且相比于傳統(tǒng)的透析袋來說，已經(jīng)將脫鹽時間由36 h縮短到了9.78 h。綜合考慮，當(dāng)預(yù)脫鹽率為40%時，脫鹽工時短，能耗小且此時溶液質(zhì)量分數(shù)較佳。

2.3 絲素蛋白氨基酸組成

對脫鹽后所得絲素蛋白進行氨基酸含量分析，100 g絲素蛋白中：組氨酸0.41%、賴氨酸0.49%、苯丙氨酸1.50%、天門冬氨酸2.69%、蘇氨酸1.13%、絲氨酸12.60%、酪氨酸10.74%、亮氨酸0.62%、異亮氨酸1.88%、纈氨酸3.81%、甘氨酸36.55%、丙氨酸27.85%、谷氨酸2.41%。

由以上數(shù)據(jù)可看出甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸和絲氨酸約占總組成的87%，很多功能性實驗證實了這4種氨基酸以及其所構(gòu)成的多肽都具有優(yōu)良的生理功能，其中含量最高的甘氨酸可以很好地吸收紫外線，另外占總含量12.60%的絲氨酸不僅可與紫外線進行光化反應(yīng)，還可有效地抑制黑色素的形成。

2.4 絲素蛋白結(jié)構(gòu)分析

將絲素蛋白溶液直接冷凍干燥得到絲素蛋白粉樣品A，取一定體積絲素蛋白溶液加入適量無水乙醇，得到白色沉淀，經(jīng)干燥后得到樣品B。利用掃描電鏡(SEM)分別對樣品A、B進行觀察，結(jié)果如圖4所示。

圖4 絲素蛋白粉掃描電鏡照片(×500)Fig.4 SEM images of silk fibroin powder(×500).(a)Sample A；(b)Sample B

對比圖4(a)、4(b)可知，樣品A呈塊狀，粒徑較大，樣品B的顆粒直徑明顯小于樣品A，而且顆粒大小均勻，表面具有細小的凹凸孔洞，增大了比表面積，會增加對紫外線的散射，使其對紫外線具有更好的阻擋防護作用。樣品B用于化妝品中可更加均勻地鋪展到皮膚表面，另外由于絲素蛋白本身具有良好的親和性，不會造成皮膚過敏，而且由于較小的粒徑，即使進入了皮膚的毛孔也會被分解吸收。

3 結(jié) 論

本文旨在解決絲素蛋白溶液制備過程中存在的耗時和耗能等問題，通過對主要影響因素的分析研究，最終得到了較為滿意工藝條件，初步達到了高效節(jié)能的項目預(yù)期，其中：

1)確定了擴散滲析-電滲析集成脫鹽工藝參數(shù)：料液質(zhì)量分數(shù)為5%，擴散滲析預(yù)脫鹽率為40%，在此工藝條件下進行絲素蛋白溶液的脫鹽可以進一步降低脫鹽能耗，縮短脫鹽工時。

2)測定了絲素蛋白的氨基酸組成，并且利用掃描電鏡觀察不溶性絲素蛋白粉的形貌特征。由氨基酸分析可看出絲氨酸和甘氨酸含量總和接近50%，由電鏡掃描得到不溶性絲素蛋白粉的粒徑較小且分布均勻，因此不溶性蠶絲蛋白粉不僅可以吸收一部分紫外線，還可以散射一部分紫外線，用在化妝品中既能被皮膚吸收，又具有很好的防曬功能。

參考文獻：

[1] 倪莉, 王璋, 許時嬰. 可溶性絲素粉末的制備[J].無錫輕工大學(xué)學(xué)報, 2000(2):146-149.

NI Li, WANG Zhang, XU Shiying. Preparation of silk fibroin powder[J]. Journal of Wuxi University of Light Industry, 2000(2):146-149.

[2] ZHU M, WANG K, MEI J, et al. Fabrication of highly interconnected porous silk fibroin scaffolds for potential use as vascular grafts [J]. Acta Biomater, 2014, 10:2014-23.

[3] TUNA Y, PEGGY C, DAVID L, et al. Vortex-induced injectable silk fibroin hydrogels [J]. Biophysical Journal, 2009, 97(7): 2044-2050.

[4] 蘇鋒, 楊瑞金, 許時嬰. 可溶性絲素蛋白溶液脫鹽技術(shù)[J]. 無錫輕工大學(xué)學(xué)報,2004(4):56-59.

SU Feng, YANG Ruijin, XU Shiying. Soluble silk fibroin solution desalination technology [J]. Journal of Wuxi University of Light Industry, 2004(4):56-59.

[5] 周鳳娟, 許時嬰, 楊瑞金, 等. 納濾技術(shù)在絲素活性肽生產(chǎn)中的應(yīng)用[J]. 膜科學(xué)與技術(shù),2008(3):83-86,99.

ZHOU Fengjuan, XU Shiying, YANG Ruijin, et al. Application of nanofiltration technology in the production of silk fibroin bioactive peptides[J]. Membrane Science and Technology, 2008(3):83-86,99.

[6] 中國科學(xué)院上海有機化學(xué)研究所. 絲肽、制備方法和應(yīng)用: 103897021A[P]. 2014-07-02.

Shanghai Institute of organic chemistry, Chinese Academy of Sciences. Silk peptide, preparation method and application: 103897021A[P]. 2014-07-02.

[7] 周鳳娟, 許時嬰, 楊瑞金, 等. 滲析分離絲素蛋白鹽溶液的研究[J]. 膜科學(xué)與技術(shù), 2004(6):25-28.

ZHOU Fengjuan, XU Shiying, YANG Ruijin, et al. Study on the separation of fibroin solution by dialysis[J]. Membrane Science and Technology, 2004(6):25-28.

[8] 袁慧勇. 不溶性蠶絲蛋白超細粉的制備及應(yīng)用[D]. 保定：河北大學(xué),2010:8-9.

YUAN Huiyong. Preparation and application of insoluble silk protein superfine powder [D]. Baoding: Hebei University, 2010:8-9.

[9] 劉珍珠, 劉紅斌, 鄧樺, 等.可溶性絲素蛋白新型脫鹽工藝研究[J]. 水處理技術(shù),2017(4):62-65.

LIU Zhenzhu, LIU Hongbin, DENG Hua, et al. Study on new desalting process of soluble silk fibroin [J]. Water Treatment Technology, 2017(4): 62-65.

[10] 劉二東, 鄭斌. 配位滴定法測定生活用水的硬度[J]. 山東化工,2016(17):79-80,83.

LIU Erdong, ZHENG Bin. Determination of hardness of domestic water by complexometric titration [J]. Shandong Chemical Industry, 2016(17): 79-80,83.

[11] 董文秀,李軍生,李秋杰,等. 光譜法研究鈣離子對絲素蛋白溶解過程中結(jié)構(gòu)的影響[J]. 分析測試學(xué)報,2014,12:1410-1415.

DONG Wenxiu, LI Junsheng, LI Qiujie, et al. The spectrum method to study the structure of the calcium ion in the process of silk fibroin dissolve effect [J]. Journal of Analysis Test, 2014, 12:1410-1415.

[12] 劉珍珠. 絲素蛋白溶液的脫鹽技術(shù)研究及其在紡織上的應(yīng)用[D].天津：天津工業(yè)大學(xué),2017:22-25.

LIU Zhenzhu. Study on desalination of silk fibroin solution and its application in textile[D].Tianjin: Tianjin Polytechnic University,2017:22-25.