甘露消毒丹及其揮發油對流感病毒感染小鼠肺部炎癥相關因子的影響

劉光華　賈曉　儒敏娜

【摘要】 目的：觀察甘露消毒丹（Ganlu Xiaodu Mircropill，GXM）及其揮發油對流感病毒（influenza virus，IV）感染小鼠肺組織病理炎癥、血清IL-6、TNF-α含量及肺組織NS1、NF-κB表達的影響，探討其抗IV感染的機制。方法：SPF級BALB/c小鼠108只，隨機分為正常組（A組）、模型組（B組）、GXM灌胃組（C組）、GXM滴鼻組（D組）、GXM合用組（E組）、奧司他韋組（F組），除A組外，其余5組以IV FM1-6-E2滴鼻造模。于造模后第3、7、10天進行取材，對小鼠肺組織病理炎癥程度進行評分，并計算肺指數及干濕比，在電鏡下觀察肺組織超微結構，采用ELISA法檢測血清中IL-6、TNF-α的含量，采用qPCR方法檢測肺組織中NS1的基因表達，采用Western Blot法檢測肺組織NF-κB的表達。結果：IV感染后，小鼠肺組織出現炎癥改變，其肺組織病理評分、肺指數均升高，干濕比降低，第7天炎癥最為嚴重。電鏡下可見肺泡上皮細胞腫脹，纖毛減少、脫落，細胞器減少。血清IL-6、TNF-α含量均升高，肺組織NF-κB表達升高，于第3天達峰值，而后降低；NS1表達亦升高，之后逐步下降。與B組比較，各治療組均能夠減輕肺部炎癥，降低病理評分、肺指數，升高干濕比，降低TNF-α含量，下調NF-κB表達，其中尤以E、F組作用最為明顯（P<0.05）。治療第3天，與B組比較，D、E、F組均能下調NS1的表達（P<0.05），而C組與B組比較，差異無統計學意義（P>0.05）；C、E、F組均能夠降低IL-6含量（P<0.05），而D組與B組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。治療第7天，C組能夠下調NS1表達，D組能夠降低IL-6含量（P<0.05）。結論：GXM可降低IV感染后肺部炎癥，降低NS1蛋白的表達；減少促炎因子的釋放，其滴鼻灌胃合用較單一給藥有優勢。

【關鍵詞】 流感病毒； 甘露消毒丹； 揮發油； 細胞因子

Effects of Ganlu Xiaodu Micropill and Its Volatile Oil on Lung Inflammation Related Factors in Mice Infected with Influenza Virus/LIU Guanghua，JIA Xiaoru，MIN Na，et al.//Medical Innovation of China，2018，15（03）：001-006

【Abstract】 Objective：To observe the effects of Ganlu Xiaodu Micropill（GXM） and its volatile oil on pathological inflammation，IL-6 and TNF-α in serum，and the expression of NS1 and NF-κB in lung tissue of mice infected with influenza virus（IV），to explore the mechanism of anti IV infection.Method：108 SPF BALB/c mice were randomly divided into normal group （group A），model group（group B），GXM lavage group（group C），GXM nasal drops group（group D），GXM group（group E），Oseltamivir group（group F）；except group A，the other

5 groups were made models with IV FM1-6-E2 nasal.On the third，seventh，tenth day after modeling，pathological inflammation were scored，lung index and the ratio of dry and wet in mice lung tissue were assessed，and ultra structure of lung tissue was observed under electron microscope，ELISA method was used to detect the content of IL-6 and TNF-α in serum，the expression of NS1 gene in lung tissue was detected by qPCR method， and NF-κB by Western Blot method.Result：After IV infection，inflammation changes in the lung tissue of mice，the lung pathological score and lung index increased；the ratio of dry and wet decreased，on seventh day，inflammation was the most serious.Under electron microscope，alveolar epithelial cells of mice lung tissue swelled，the cilia decreased and shedding，organelles decreased.The content of IL-6 and TNF-α in serum and the expression of NF-κB in lung tissue increased，and all reached peak on the third day，then decreased，the expression of NS1 increased in the same time.Compared with group B，the treatment groups can reduce lung inflammation，reduce the pathological score and lung index，rise the ratio of dry and wet，reduce the content of TNF-α，cut the expression of NF-κB，especially in group E and F were the most obvious（P<0.05）.On the third day of treatment，the expression of NS1 was down regulated in group D，E and F（P<0.05），while the effect of group C was not obvious（P>0.05）.Group C， E and F could reduce the content of IL-6（P<0.05），while the effect of group D was not obvious（P>0.05）.On the seventh day of treatment，group C could reduce the expression of NS1，and group D could reduce the content of IL-6（P<0.05）.Conclusion：GXM can reduce lung inflammation and the expression of NS1 protein after IV infection，and reduce the release of proinflammatory factors，the combination of nasal drops and lavage administration has advantage over single administration.

【Key words】 Influenza virus； Ganlu Xiaodu Micropill； Volatile oil； Cytokine

First-authors address：Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.03.001

流行性感冒（流感）是一種常見的急性呼吸道傳染病，由流感病毒（influenza virus，IV）感染引起，其發病率高，傳染性強，人群普遍易感[1]。臨床表現輕重不一，輕者僅表現為感冒，病程短、癥狀輕、預后良好，重者可發展為流感病毒性肺炎，甚則危及生命[2]。中醫藥在防治IV感染方面具有重要的作用，臨床多以辛涼解表或清熱解毒之品治之每獲較好療效。但近年由于霧霾等環境污染及人們生活方式的改變、飲食的偏嗜，體虛濕盛或濕熱內蘊者日益增多，IV等病原微生物極易附著于PM2.5等微塵顆粒侵襲人體，并因人的體質而從化，發為濕熱性質的病證。臨床已有報道用甘露消毒丹（Ganlu Xiaodu Micropill，GXM）治療IV感染取得了較好的療效[3]。本研究從濕熱蘊毒立論，探討清熱解毒、利濕化濁的GXM滴鼻、灌胃兩種不同給藥途徑對IV感染小鼠肺部炎癥的影響。通過觀察小鼠肺組織病理炎癥、肺指數、干濕比、肺組織超微結構、血清中IL-6、TNF-α含量變化及肺組織中NS1、NF-κB表達，揭示GXM一方兩用對IV感染的效用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株 甲型流感病毒鼠肺適應株A/FM1/47（H1N1），由遼寧中醫藥大學附屬醫院病毒室保存。

1.1.2 實驗動物 SPF級BALB/c小鼠108只，體重（20±2）g，雌雄各半，購買于遼寧長生生物技術有限公司，生產合格證號：SCXK（遼）2013-009，使用合格證號：SYXK（遼）2015-0001。

1.1.3 藥物及制備 GXM藥物組成：滑石、黃芩、茵陳、石菖蒲、川貝母、木通、藿香、連翹、白蔻仁、薄荷、射干，中藥飲片購于遼寧中醫藥大學附屬醫院門診藥局，經遼寧中醫藥大學中藥分析教研室鑒定為正品。飲片以8倍量70%乙醇加熱回流提取3次，1 h/次，合并每組3次提取的藥液，回收溶劑并濃縮，制成含生藥1 g/mL混懸液。揮發油制備：將中藥粉碎，加8倍量水浸泡，裝入冷凝器中，水蒸氣蒸餾提取6 h，分層分取揮發油，制成含生藥6 g/mL的藥液。磷酸奧司他韋顆粒（生產廠家：宜昌長江藥業，批準文號：國藥準字H2009372）75 mg，配成1 mg/mL的溶液。每組藥液均4 ℃保存備用。

1.1.4 試劑與儀器 Trizol總RNA提取試劑，Invitrogen公司；RT-PCR試劑盒、DEPC、DNAmarker DL2000，購于大連寶生物公司；小鼠IL-6、TNF-α ELISA試劑盒，Phospho-NF-κB p65抗體試劑盒，GAPDH，ECMII of Western-blot檢測試劑盒濃縮型免IgG二抗，購于武漢博士德公司。

1.1.5 主要儀器 TP1020型自動組織脫水處理機；EG1150型石蠟包埋機（LEICA，德國）；RM2135型病理精密輪轉切片機（LEICA，德國）；BX50F4型顯微鏡（OLY-MPUS）；熒光定量PCR儀（LC-Ⅱ）；IM71型酶標儀；PowerPac Universal電泳通用型電源；Trans-Blot SD半干轉印系統（Bio-Rad，美國）；FlourChem Q蛋白印記成像系統（Proteinsimple，美國）；低溫高速離心機（Heraeus，德國）；H-7650型透射電鏡（日本株式會社）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 用隨機數字表法將小鼠分為6組，分別為正常組（A組）、模型組（B組）、GXM灌胃組（C組）、GXM滴鼻組（D組）、GXM合用組（E組）、奧司他韋組（F組），每組18只，對各組小鼠進行標記稱重。

1.2.2 模型制備 實驗動物適應性飼養1 d后，除A組動物外，其余動物在乙醚輕度麻醉下，經鼻腔接種甲型流感病毒FM1株（0.1 mL/只）。A組動物隔離飼養在同等條件下的房間，并按同樣方法鼻腔接種生理鹽水0.1 mL。

1.2.3 給藥方法 C組、E組、F組于感染后24 h開始灌胃給藥，0.3 mL/（d·次），連續10 d；D組、E組于感染后24 h開始滴鼻給藥，0.04 mL/（d·次），連續10 d。A組、B組同步灌胃生理鹽水0.3 mL。最后一次給藥后禁水、禁食4 h。

1.2.4 標本采集 于造模后第3、7、10天采集標本，每組取6只，稱重后摘眼球取血，儲存于促凝管中，以4 000 r/min的速度離心5 min，取上層血清存于EP管中，-80 ℃冰箱冷藏以備ELISA檢測。對小鼠進行頸椎脫臼處死，在無菌操作臺將小鼠仰臥位固定，酒精消毒頸部及胸腹部，以無菌專用器械進行操作，打開胸腔，取出整個肺臟，稱取肺重，計算肺指數（肺質量/體質量×100%）。取左肺放入4%多聚甲醛中固定，常規脫水、石蠟包埋、行HE染色，取右肺組織-80 ℃凍存，以備Western Blot、qPCR檢測。根據文獻[4]進行肺組織病理學評分。左肺下葉單獨稱重，置于37 ℃恒溫箱中48 h后，再次稱重，計算干濕比（干重/濕重）。第7天處死小鼠后迅速取其右肺上葉組織，2.5%戊二醛預固定，1%鋨酸固定，環氧樹脂浸透、包埋，切片，乙酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛雙層染色，置于透射電鏡下觀察肺組織超微結構的變化。

1.2.5 qPCR法NS1基因含量測定 引物根據文獻[5]設計，NS1上游引物：5-ATGGATCCAAACACTGTGTC-3；下游引物：5-TCAAACTTCTGACCTAATTGTTCC-3；GAPDH，G1：5-ACCACCATGGAGAAGGCTGG-3，G2：5CTCAGTGTAGCCCAGGATGC 3，由北京六合華大基因合成。取肺組織制造細胞懸液，用Trizol提取細胞總RNA。分析RNA的純度及完整性，檢測RNA質量合格后，進行反轉錄，以反轉錄產物為模板，加入NS1的引物，進行qPCR檢測。

1.2.6 血清IL-6、TNF-α表達水平檢測 采用雙抗體夾心ELISA法，測定小鼠血清中IL-6、TNF-α含量，分別用小鼠IL-6、TNF-α的ELISA試劑盒。檢測程序按照試劑盒說明書進行。

1.2.7 Western Blot法檢測NF-κB蛋白的表達 用總蛋白提取試劑提取總蛋白，離心取上清液。BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，提取液中加入5×SDS上樣緩沖液，100 ℃變性10 min，蛋白上樣每孔10 μL，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉膜30 min，2%BSA室溫封閉2 h。一抗室溫孵育2 h，4 ℃過夜，TBST 10 min/次洗膜（3次），二抗室溫孵育1 h，TBST 10 min/次洗膜（3次）。ECL發光，Fluor Chem Q蛋白質印跡成像系統顯色。

1.3 統計學處理 所有實驗計量數據均以均數±標準差（x±s）表示，用SPSS 20.0統計軟件分析，統計方法采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠肺指數、干濕比及病理評分比較 A組第3、7、10天的肺指數均低于B組，干濕比均高于B組，差異均有統計學意義（P<0.05）。IV感染后，B、C、D、E、F組小鼠肺組織炎癥病理評分、肺指數均于第7天達峰值。治療第3天，C、D組與B組的病理評分、肺指數比較，差異均無統計學意義（P>0.05），C組與E組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；治療第7、10天，各治療組與B組的病理評分、肺指數比較，差異均有統計學意義（P<0.05），C、D組與E組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。IV感染后，各時間點小鼠肺組織干濕比均于第3天達谷值。治療第3天，C、D組與B組的干濕比比較，差異均無統計學意義（P>0.05），且C、D組與E組的干濕比比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；治療第7天，除D組外，其余各治療組的干濕比與B組比較，差異均有統計學意義（P<0.05），且C、D組與E組的干濕比比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；治療第10天，各治療組干濕比與B組比較，差異均有統計學意義（P<0.05），且C、D組與E組的干濕比比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 小鼠肺組織超微結構改變 正常小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞結構完整，細胞膜表面微絨毛豐富，血管內皮細胞及基膜完整（圖1A）。IV感染小鼠肺泡上皮細胞腫脹，纖毛減少，脫落（圖1B）；細胞表面破壞，膠原纖維化，纖毛脫落，稀疏（圖1C）；血管明顯腫脹，核染色質凝集粗塊狀，聚集于細胞核周圍，Ⅱ型細胞板層小體增多（圖1D）。

2.3 各組小鼠血清中IL-6、TNF-α含量比較 IV感染后，B、C、D、E、F組小鼠血清中IL-6含量于治療第3天達峰值，然后逐漸降低。治療第3天，C、E、F組的IL-6含量均低于B組，差異均有統計學意義（P<0.05），而D組與B組比較，差異無統計學意義（P>0.05），C、D組與E組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；治療第7天，各治療組的IL-6均低于治療第3天，差異均有統計學意義（P<0.05），但C組與E組比較，差異無統計學意義（P>0.05）；治療第10天，各治療組的IL-6均低于治療第7天，且C、D組與E組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表2。治療第3天，各治療組血清中TNF-α含量均出現峰值，而后降低。治療第3、7天，各治療組TNF-α含量較B組均有所下降，其中E組效果最為明顯，且C、D組與E組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；治療第10天，各組均顯著低于B組，其中D組與E組比較，差異均有統計學意義（P<0.05），C組與E組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。

2.4 各組小鼠肺組織NS1基因表達結果比較 治療第3天，D、E、F組的NS1基因表達較B組均有所下降，差異均有統計學意義（P<0.05），而C組與B組比較，差異無統計學意義（P>0.05）；治療第7、10天，各治療組的NS1基因表達較B組均有所下降，差異均有統計學意義（P<0.05），且C、D組與E組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表4。

2.5 各組小鼠肺組織NF-κB表達結果的比較 IV感染后，B組較A組肺組織中NF-κB表達明顯增多，于治療第3天達峰值。治療第3、7、10天，各治療組的NF-κB均低于B組，且C、D組均高于E組多，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖2、表5。

3 討論

IV變異快，動物源性的IV在人群中的高致死率和廣泛流行性，已經引起了全世界的高度關注[6]。當前國內霧霾天氣頻繁出現，兒童、老年人等弱勢群體IV感染率明顯升高。有研究發現霧霾期間兒童患呼吸系統疾病的風險提高26.95%[7]。IV屬正粘病毒科，為單分子負鏈RNA病毒，由包膜和致密的病毒核心組成。NS1是IV最重要的一個非結構蛋白，在IV感染宿主細胞中，NS1蛋白高水平表達，是引起宿主受損的重要因素之一[8]；NF-κB為核轉錄因子，能夠與因啟動子部位的κB位點特異性結合，激活狀態下進入細胞核并調控DNA的轉錄過程，參與機體免疫應答、炎癥反應等[9]。IV感染機體后，機體啟動免疫應答機制，NS1蛋白表達升高，同時激活了NF-κB信號通路，活化的NF-κB調控炎癥因子IL-6、TNF-α等表達轉錄，引起宿主細胞的炎性損傷甚至凋亡[10]。促炎因子IL-6是炎癥反應中的重要細胞因子，參與肺部炎癥病理過程[11]；TNF-α是重要的炎癥促進因子，在體內主要產生單核巨噬細胞，對肺臟具有強烈的毒性，它能誘導肺內皮細胞活化、白細胞遷移、粒細胞脫顆粒和毛細血管滲漏等，從而誘發并進一步加重炎癥反應[12]。本實驗結果顯示，IV感染后小鼠肺指數升高，干濕比降低，電鏡下可見小鼠肺組織的細胞結構破壞，核膜與質膜模糊不清，細胞器減少，細胞漿內出現較多的空泡樣病變，肺內炎癥明顯。肺組織NS1蛋白表達增多，早期明顯；NF-κB蛋白表達增加，于治療第3天達到峰值；血清中IL-6、TNF-α含量均升高，于第3天達到峰值，然后逐漸降低。在IV感染小鼠初期，細胞因子IL-6和TNF-α含量及肺組織中NF-κB、NS1表達均呈上升趨勢，這可能與感染后的免疫應激有關。

中醫學認為，IV肺炎系氣候反常，感受邪毒、癘氣導致肺氣郁痹、痰瘀阻滯而發病，霧霾天氣，濕濁彌漫，易與時疫邪毒膠結致病，濕熱交蒸，郁阻氣分，蘊毒上壅，具有“濕毒”“肺痹”特征[13]。“所受之邪，每從其人之臟氣而化”，故IV極易附著于霧霾微塵顆粒侵襲人體，感染后可從化于人體的濕熱體質而呈濕熱證的特點。臨床治療選用GXM，該方為“治濕溫時疫之主方”，芳香辟穢以醒竅，清熱祛濕以化痰，解毒化濁以開痹。方中芳香辛散的藥味含有多種揮發油成分，可以滴鼻給藥。不同的成分、不同的提取方法、不同的給藥途徑，同種處方亦會產生不同的療效點。本次研究發現GXM能夠減輕肺組織超微結構病變程度，正向調節炎癥因子，減緩IV感染小鼠急性期的炎性反應，降低肺組織中NS1、NF-κB蛋白的表達。經GXM治療后，各時間點小鼠肺指數、肺組織炎癥病理評分均降低、干濕比均升高，逐漸接近于正常，其中GXM合用組起效時間最早，其次為GXM灌胃組、滴鼻組。GXM能夠降低TNF-α、IL-6含量和抑制NF-κB表達水平，GXM合用組效果最好，第3天即起效，GXM灌胃組第7天亦發揮療效，而GXM滴鼻組療效較弱。GXM能夠降低NS1蛋白表達水平，GXM合用組效果最好，起效時間最早（第

3天）；GXM滴鼻組在第3天能夠降低NS1表達，而GXM灌胃組則于第7天發揮療效。GXM滴鼻組起效迅速且療效明顯，提示這可能與GXM含有的揮發油經鼻吸收后快速地誘導黏膜免疫反應，且直接滅殺IV有關。現代藥理研究提示，藿香、石菖蒲、茵陳、薄荷等都含有揮發性物質[14-18]。

綜上所述，GXM具有抗IV感染的作用，能夠有效控制IV感染小鼠肺部炎癥，這可能與抑制相關炎癥因子、降低NS1蛋白的表達有關。GXM揮發油滴鼻在早期抗病毒作用中效果明顯，抗感染過程中揮發油和醇提物合用，較單一給藥效果更加明顯，且有一定的時效性，其深入作用機制有待于進一步研究。

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（收稿日期：2018-01-08） （本文編輯：張爽）