納米銀抗菌凝膠對大鼠深Ⅱ度燙傷創面愈合及巨噬細胞數量和微血管密度的影響

張紫豪 高素玥 崔文浩

[摘要]目的：觀察納米銀抗菌凝膠聯合重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（rhGM-CSF）對大鼠深Ⅱ度燙傷創面愈合、巨噬細胞數量以及微血管再生的影響。方法：選取健康SD大鼠114只（6只作為非燙傷正常對照組，不作任何處理），剩余SD大鼠按照隨機數字法分為3組，rhGM-CSF組、聯合組和模型組，每組36只。制作深Ⅱ度燙傷創面模型，rhGM-CSF組大鼠創面涂抹rhGM-CSF，聯合組應用納米銀抗菌凝膠和rhGM-CSF涂抹，模型組不作任何處理。比較各組創面愈合率，創面巨噬細胞數量以及微血管密度數量。結果：同一時間點，rhGM-CSF組和聯合組愈合率均高于模型組，且聯合組愈合率顯著大于rhGM-CSF組，差異有統計學意義（P<0.05）；聯合組第3、11、14天創面浸潤巨噬細胞數量均少于模型組和rhGM-CSF組（P<0.05）；第3、7、11天，聯合組微血管數量顯著高于模型組和rhGM-CSF組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：納米銀抗菌凝膠聯合rhGM-CSF治療深Ⅱ度燙傷效果確切，可以通過影響燙傷創面巨噬細胞數量和微血管生成促進燙傷創面愈合。

[關鍵詞]納米銀抗菌凝膠；重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子；燙傷；巨噬細胞；微血管

[中圖分類號]R644 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2018）03-0104-04

Effect of Nano Silver Antibacterial Gel on the Deep Ⅱ Degrees of Rat Scalded Wound Healing and the Number of Macrophages， the Microvascular Density

ZHANG Zi-hao 1，GAO Su-yue2，CUI Wen-hao3

（1.Chinese PLA General Hospital，Beijing 100000，China；2.the Second Hospital Affiliated to Suzhou University，Suzhou 215004，Jiangsu，China；3.the First People's Hospital of Jinzhong，Jinzhong 030600，Shanxi，China）

Abstract： Objective To observe the effect of nano silver antibacterial gel joint rhGM-CSF on the deep Ⅱ degrees of rat scalded wound healing and the number of macrophages， the microvascular density. Methods A total of 114 healthy SD rats （6 rats served as non scald normal control group， without any treatment） were selected， the remaining SD rats were randomly divided into 3 groups， the rhGM-CSF group， the combination group and the model group， 36 rats in each group. The deep second degree scald wound model was made， the rhGM-CSF group was treated with rhGM-CSF， the combination group was treated with nano silver antibacterial gel and rhGM-CSF， and no treatment was given to rats of the model group. The rate of wound healing， the number of macrophages and the number of microvessel density in each group were compared. Results At the same time， the healing rate of the rhGM-CSF group and the combination group were higher than those of the model group， and the combination group was significantly higher than the rhGM-CSF group， the difference were statistically significant （P<0.05）. The number of macrophages in the combination group on the 3， 11， 14d were less than those of the model group and the rhGM-CSF group （P<0.05）. The number of microvessels in the combination group on the 3， 7， 11d were significantly higher than those of the model group and the rhGM-CSF group （P<0.05）. Conclusion The effect of nano silver antibacterial gel joint rhGM-CSF treatment was exact， and can promote the healing of scalded wounds by affecting the number and angiogenesis of burn wounds.

Key words： nanosilver antibacterial gel； recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor； burns； macrophages； microvascular

燙傷通常可造成人體皮膚組織損傷，形成燙傷創面，其中以深Ⅱ度燙傷最為常見，深Ⅱ度燙傷會損傷到真皮乳頭層以下到達真皮深層，臨床愈合情況變異系數較大，如果處理不當就會出現炎癥反應，血管生成延緩，進而影響愈合。巨噬細胞是炎癥反應的直觀指標，CD68在巨噬細胞中表達，常常被作為巨噬細胞的可靠標記[1]。CD34是一種跨膜糖蛋白，在血管內皮細胞中能夠穩定表達，所以常常用來計算組織微血管密度，從而對毛細血管新生情況進行有效評估[2]。重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子凝膠作為一種全新的促進創面愈合的方法應用于燙傷創面，能夠提高粒細胞的吞噬細菌能力，納米銀是一種長效抗菌劑，安全性高、效力持久。本研究通過觀察納米銀抗菌凝膠聯合重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（Recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor， rhGM-CSF）對大鼠深Ⅱ度燙傷創面愈合、巨噬細胞數量以及微血管再生的影響，為臨床換藥治療提供數據支撐。

1 資料和方法

1.1 主要儀器和試劑：恒溫水浴鍋（江蘇金怡儀器科技有限公司），光學顯微鏡（上海光學儀器一廠），納米銀抗菌凝膠（武漢東信醫藥科技有限責任公司），rhGM-CSF凝膠劑（長春金賽藥業有限責任公司）。兔抗CD68和CD34多克隆抗體（武漢轉導生物科技發展有限公司）。

1.2 大鼠深Ⅱ度燙傷創面構建和分組：健康SD大鼠114只（6只作為非燙傷正常對照組），雌雄各半，體重190～200g，自上海邦耀生物科技有限公司采購，采用普通飼料進行分籠喂養，環境相對濕度50%～70%，溫度（25±2）℃，適應性喂養1周。采用1%戊巴比妥鈉溶液進行腹腔注射麻醉，硫化鈉對大鼠背部和腿部褪毛，溫水洗去脫毛劑，取仰臥位將大鼠脫毛處置于帶側支的圓底燒瓶口上（內徑25mm，瓶口溫度98℃），蒸汽熏蒸10s，造成5% TBSA深Ⅱ度燙傷模型。

模型制作成功后，按照隨機數字法則分為3組，每組36只（雌雄各半），3組大鼠燙傷創面換藥前均采用無菌棉棒蘸取0.1%醋酸氯已定溶液進行擦拭，然后再用生理鹽水進行擦拭，最后用干棉棒擦干，rhGM-CSF組大鼠創面涂抹rhGM-CSF，聯合組應用納米銀抗菌凝膠和rhGM-CSF涂抹，模型組不作任何處理。燙傷后每天換藥1次直至創面愈合，各組小鼠正常進食水。正常對照組不作任何處理。

1.3 檢測指標

1.3.1 創面愈合情況：采用高分辨率相機對創面進行拍照，保持拍攝角度和創面垂直，焦距相等，然后采用Photoshop像素法精確測定創面愈合率。創面愈合率=（初始創面面積-未愈合創面面積）/初始創面面積×100%。

1.3.2 免疫組織化學檢測創面巨噬細胞數量和微血管密度：在燙傷模型建立第1、3、7、11、14、17天，每個時間點各組均取6只大鼠（雌雄各半）處死，無菌操作，取創面標本，保留創緣部分正常皮膚，立即置于10%福爾馬林溶液中固定24h，梯度酒精脫水，石蠟包埋，置于4℃冰箱中保存備用，進行巨噬細胞和微血管密度檢測。

將石蠟切片，放入40%酒精中，水浴40℃，4min，展開，置于60℃烘箱烘片。二甲苯脫蠟，梯度酒精進行水化，高溫高壓組織修復，加入3%雙氧水，室溫中10min，從而阻斷內源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗，加入5%羊血孵育30min，除去封閉液，加入一抗（兔抗CD68進行巨噬細胞標記，CD34標記血管內皮細胞），置于4℃冰箱過夜，次日取出使用PBS沖洗，滴加生物素化山羊抗兔二抗，37℃放置20min，PBS沖洗，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液，37℃放置20min，加入DAB顯色觀察。巨噬細胞計數：依據DIPICTRO標準，隨機選擇5個視野，取其平均值作為創面巨噬細胞數量。微血管計數：參照Weidne標準，選擇5個血管豐富且不重復的視野觀察，在高倍鏡下計數。

1.4 統計學分析：所有數據均于SPSS 16.0軟件中統計分析，計量資料采用平均值±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 三組大鼠創面不同時間點愈合情況比較：隨著時間的增加，三組大鼠創面愈合率均不斷增加。同一時間點，rhGM-CSF組和聯合組愈合率均高于模型組，且聯合組愈合率顯著大于rhGM-CSF組差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 三組大鼠創面不同時間點組織巨噬細胞數量檢測結果：三組大鼠創面巨噬細胞數量均是先增加后減小。聯合組第3、11、14天創面浸潤巨噬細胞數量均少于模型組和rhGM-CSF組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2，圖1。

2.3 三組大鼠創面不同時間點組織微血管數量檢測結果：三組大鼠創傷后第3、7、11、14、17天微血管數量均高于正常對照組，差異具有統計學意義（P<0.05）。三組大鼠創面微血管數量傷后1～7d遞增，之后開始下降，在第3、7、11天，聯合組微血管數量顯著高于模型組和rhGM-CSF組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3、圖2。

3 討論

深Ⅱ度燙傷創面作為燙傷領域研究的熱點，引起了臨床醫務工作者和科研工作者的廣泛關注。深Ⅱ度燙傷創面的愈合是一個復雜但有序的過程，需要在自身機體內各種誘導和調控下進行，需要經歷血管反應（止血和凝血）、細胞炎癥反應、增殖及修復等過程[3]。

在創面修復過程中，巨噬細胞作為主要細胞，參與到愈合過程中的各個階段。研究表明在正常皮膚組織中，巨噬細胞均處于活化狀態，只有在外界譬如燙傷等刺激作用下才會激活。但其在燙傷愈合過程所起作用意見不一，有學者[4]認為巨噬細胞的存在可以促進創傷愈合，而有學者[5]則認為巨噬細胞會引起炎癥反應，從而延遲創面愈合。有研究報道燙傷后創面的巨噬細胞偏向M1型，因此細胞開始大量分泌促炎因子TNF-α， 而抗炎因子IL-10水平下降。據報道[6]，在創面發生感染或創面條件不可控時，巨噬細胞炎性反應就會增強，從而加重燙傷程度，延遲愈合。而納米銀抗菌凝膠采用納米技術，將銀離子制成納米級顆粒，緩慢釋放，持續殺菌，避免了創面細菌侵入內部發生感染，且也有報道稱納米銀可以對巨噬細胞進行誘導或優化，從而促進抗炎因子的分泌。研究表明[7]中性粒細胞在燙傷創面浸潤可以迅速清除壞死組織，rhGM-CSF能夠促進中性粒細胞活化，增強其分泌功能，有利于創面細胞碎片和病原體的清除。本研究采用納米銀抗菌凝膠聯合rhGM-CSF對深Ⅱ度燙傷大鼠進行治療，其愈合率顯著高于rhGM-CSF單一用藥組，這可能是納米銀抗菌凝膠抑制了細菌侵入，避免了創面感染，同時rhGM-CSF促進清除病原體，兩者聯合作用，縮短了愈合周期。通過免疫組織化學法檢測燙傷創面巨噬細胞，結果顯示其數量先增加后減少，處在動態變化趨勢，這可能和趨化因素以及創面缺乏機械屏障有關。燙傷后，聯合組各個時間點巨噬細胞數量均比模型組和rhGM-CSF組要少，提示，聯合用藥對燙傷后創面巨噬細胞的數量有一定的影響，可以將創面局部巨噬細胞數量控制在一定范圍參與愈合。

研究表明[8-9]，血管生成參與到許多病理和生理過程當中，尤其在創面愈合過程中，需要充足大量的新生血管，為創面組織提供營養的氧氣，從而促進創面愈合。有研究報道[10]稱新生血管障礙或者發生延遲是創面延遲愈合的主要原因，如果創面血管數量增加，創面愈合時間就會縮短。本研究結果顯示在第1、3、7和11天，聯合組微血管數量均高于模型組和rhGM-CSF組，且在第3、7和11天，rhGM-CSF組微血管數量比燙傷模型組多。提示納米銀抗菌凝膠和rhGM-CSF能促進血管生成，聯合用藥其促進血管生成能力更強。

綜上所述，納米銀抗菌凝膠和rhGM-CSF聯合用藥治療深Ⅱ度燙傷效果確切，且納米銀抗菌凝膠可以通過影響燙傷創面巨噬細胞數量和微血管生成來影響燙傷創面的愈合。

[參考文獻]

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[收稿日期]2018-01-20 [修回日期]2018-02-28

編輯/朱婉蓉