咪喹莫特調節Th1、Th2細胞相關趨化因子對兔耳增生性瘢痕創面愈合和瘢痕增生的影響

陳方

[摘要]目的：探討咪喹莫特調節Th1、Th2細胞相關趨化因子對兔耳增生性瘢痕創面愈合時間和瘢痕增生的影響。方法：選取健康清潔級新西蘭大耳實驗兔40只，隨機分為空白組、模型組、凡士林組以及咪喹莫特組，每組10只。模型組、凡士林組以及咪喹莫特組建立兔耳瘢痕模型，14d創面完全上皮化后，凡士林組涂抹凡士林軟膏0.1g，1次/d；咪喹莫特組外用咪喹莫特軟膏0.1g，1次/d，連續42d。觀察并比較各組實驗兔的大體情況，瘢痕增生指數，Th1、Th2 細胞相關趨化因子CXCL10、CXCL12、CCL2、CCL3、CCL5、CCL7、CCL13水平，完全上皮化時間及創面愈合時間。結果：模型組與凡士林組28d達到增生巔峰；與模型組相比，凡士林組及咪喹莫特組的瘢痕增生指數、創面愈合時間均較低，且咪喹莫特組低于凡士林組，差異有統計學意義（P<0.05）。與模型組相比，凡士林組及咪喹莫特組的CCL2、CCL3、CCL5、CCL7、CCL13水平較低，CXCL10、CXCL12水平升高，差異有統計學意義（P<0.05）；與凡士林組相比，咪喹莫特組的CCL2、CCL3、CCL5、CCL7、CCL13水平降低，CXCL10、CXCL12水平較高（P<0.05）。三組實驗兔完全上皮化時間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。結論：咪喹莫特能夠調節Th1、Th2細胞相關趨化因子，縮短兔耳增生性瘢痕創面的愈合時間。

[關鍵詞]咪喹莫特；趨化因子；兔耳瘢痕模型；創面愈合時間；增生性瘢痕

[中圖分類號]R619+.6 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2018）03-0100-04

Effect of Imiquimod Regulating Th1 and Th2 Cell-associated Chemokines on Wound Healing and Scar Proliferation in Rabbits

CHEN Fang

（Department of Medical Cosmetology，Linyi Central Hospital，Linyi 276400，Shandong，China）

Abstract： Objective To investigate the effect of imiquimod regulating Th1 and Th2 cell-associated chemokines in wound healing and scar proliferation in rabbits. Methods 40 healthy and clean New Zealand white rabbits were selected and randomly divided into the blank group， the model group， the vaseline group and the imiquimod group， 10 rabbits in each group. The model group， the vaseline group and the imiquimod group set up rabbit ear scar model. The vaseline group and the imiquimod group were given the appropriate treatment after 14 days of surgery， the vaseline group were treated with vaseline ointment 0.1g， 1 time/d， and the imiquimod group were treated with imiquimod ointment， treatment for 42 consecutive days. The level of scar hyperplasia index （SEI）， the levels of Th1 and Th2 cell-associated chemokines CXCL10， CXCL12， CCL2， CCL3， CCL5， CCL7 and CCL13， the complete epithelialization time and wound healing time were observed and compared. Results The model group and the vaseline group reached the peak of hyperplasia in 28 days. The scar proliferation index and wound healing time of the vaseline group and the imiquimod group were lower than those of the model group， and the imiquimod group was lower than that of the vaseline group， the difference were statistically significant（P<0.05）. Compared with the model group， the levels of CCL2， CCL3， CCL5， CCL7 and CCL13 in the vaseline group and the imiquimod group were decreased， CXCL10 and CXCL12 levels were increased（P<0.05）. Compared with the vaseline group， the levels of CCL2， CCL3， CCL5， CCL7 and CCL13 in the imiquimod group were lower， and the level of CXCL10 and CXCL12 was higher（P<0.05）. There were no statistical difference in the time of complete epithelialization between the three groups （P>0.05）. Conclusion Imiquimod can regulate Th1 and Th2 cell-associated chemokines and shorten the healing time of the wound of hypertrophic scar in rabbit ears.

Key words： imiquimod； cell-associated chemokines； rabbit ear scar model； scar wound healing time； hypertrophic scar

增生性瘢痕是創傷愈合過程中皮膚上皮化后，局部組織繼續增生，皮膚纖維化，膠原大量沉積，是外科臨床的常見病，在各種創傷如燒傷、手術后常見[1]。目前臨床仍未有較為有效的治療方法。增生性瘢痕的發病機制至今尚不完全清楚，有學者研究證實[2]，免疫因素在此過程中具有重要作用。輔助性T淋巴（Th）細胞群是瘢痕增生過程中的重要影響因素，其是人體免疫系統中的重要免疫細胞。主要亞群Th1細胞和Th2細胞在趨化因子的作用下在瘢痕組織局部聚集，產生相關細胞因子，在瘢痕的形成過程中發揮作用[3]。咪喹莫特（Imiquimod）是近年來合成的新型免疫調節劑，已經有研究證實，其能夠通過調節Th1、Th2相關因子的表達對瘢痕的增生程度產生影響，但也有學者認為咪喹莫特的調節細胞因子的作用不能對瘢痕的增生產生相關的治療作用[4]。因此，本實驗從趨化因子的角度，通過觀察兔耳增生性瘢痕創面愈合時間和瘢痕增生情況，探討咪喹莫特通過調節Th1、Th2細胞相關趨化因子CXCL10、CXCL12、CCL2、CCL3、CCL5、CCL7、CCL13的水平，對瘢痕增生的影響情況，現報道如下。

1 資料和方法

1.1 實驗動物：實驗動物為健康的清潔級新西蘭大耳實驗兔40只，年齡1.0～1.5歲，體重2.5～3.0kg，均由本院實驗動物中心提供，雌雄不限。所有實驗兔經編號后由本院實驗動物中心負責飼養，隨機分為空白組、模型組、凡士林組及咪喹莫特組，每組10只。

1.2 儀器及試劑：手術器械，打孔器，臺秤，電推剪，動物實驗臺，0.3%戊巴比妥鈉（國藥準字H31021724，上海新亞藥業有限公司），光學倒置顯微鏡（奧林巴斯），咪喹莫特軟膏（國藥準字H20040283，珠海聯邦制藥股份有限公司中山分公司），紅霉素軟膏（國藥準字H42021726，馬應龍藥業股份有限公司），凡士林（贛食藥準字F20050006，南昌白云藥業有限公司）等。

1.3 實驗方法

1.3.1 兔耳增生性瘢痕模型建立：根據 Morris和李薈元報道的方法[5-6]，對于模型組、凡士林組以及咪喹莫特組建立兔耳增生瘢痕模型。耳緣靜脈緩慢注射0.3%戊巴比妥鈉對實驗兔進行全身麻醉，劑量1.5mg/kg，確認麻醉成功后，將實驗兔固定于固定架上，在無菌條件下，采用電推剪推凈兔耳雙側表面短毛，消毒后在每只兔的兔左耳耳腹側作直徑為1cm的圓形全層皮膚缺損創面6個，在此過程中避開可見血管，軟骨膜一并去除，每個創面間距為1.5cm以上。對于出血處給予止血，無效時給予電凝止血，創面均涂抹紅霉素軟膏防止感染，暴露創面，使其自行愈合。

1.3.2 給藥方法：凡士林組以及咪喹莫特組實驗兔于術后14d創面完全上皮化后，給予相應的治療措施，每組給藥時間相同，凡士林組采用涂抹凡士林軟膏0.1g，1次/d；咪喹莫特組外用咪喹莫特軟膏0.1g，1次/d，連續42d。模型組外用1%紅霉素軟膏，1次/d。

1.3.3 瘢痕增生指數（Scar elevation index，SEI）檢測：實驗兔瘢痕最凸點至耳軟骨表面的垂直距離a，瘢痕周圍正常皮膚至耳軟骨表面的垂直距離為b，其比值為瘢痕增生指數，其值越高，表示瘢痕的增生越明顯。SEI在1.6以上為增生性瘢痕。

1.3.4 Th1、Th2細胞相關趨化因子CXCL10、CXCL12、CCL2、CCL3、CCL5、CCL7、CCL13水平檢測：治療后采集所有實驗兔的耳緣靜脈血3ml，離心取上清液，采用ELISA法，對于所有實驗兔的Th1、Th2 細胞相關趨化因子CXCL10、CXCL12、CCL2、CCL3、CCL5、CCL7、CCL13水平進行檢測。

1.3.5 完全上皮化時間及創面愈合時間檢測：對所有實驗兔的完全上皮化時間以及創面完全愈合時間進行檢測。創面愈合標準為完全形成瘢痕組織。

1.4 統計學分析：計量數據以均數±標準差（x?±s）表示，采用t檢驗；計數資料采用%表示，采用卡方檢驗。采用SPSS 19.0統計軟件進行數據比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗兔大體情況觀察：所有建立模型實驗兔術后10d可見痂皮脫落，創面上皮化時間約為13～15d，均無感染、穿孔等情況發生。所有實驗兔瘢痕均有不同程度的增生，其中模型組實驗兔的瘢痕增生明顯，顏色紅，質硬，創面中心厚；咪喹莫特組瘢痕顏色淡，表面平，質軟，與周圍皮膚相比表面較高，創面中心增生程度較為輕微，且未見增生高峰；凡士林組瘢痕顏色淺紅，質較硬，瘢痕組織高于周圍皮膚。

2.2 瘢痕增生指數（SEI）比較結果：模型組與凡士林組28d達到增生巔峰；與模型組相比，凡士林組及咪喹莫特組的瘢痕增生指數較低，差異有統計學意義（P<0.05）；咪喹莫特組的瘢痕增生指數低于凡士林組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.3 Th1、Th2 細胞相關趨化因子CXCL10、CXCL12、CCL2、CCL3、CCL5、CCL7、CCL13水平檢測結果：與模型組相比，凡士林組及咪喹莫特組的CCL2、CCL3、CCL5、CCL7、CCL13水平較低，CXCL10、CXCL12水平升高，差異有統計學意義（P<0.05）；與凡士林組相比，咪喹莫特組的CCL2、CCL3、CCL5、CCL7、CCL13水平降低，CXCL10、CXCL12水平較高（P<0.05）。見表2。

2.4 各組完全上皮化及創面愈合時間比較：與模型組相比，凡士林組及咪喹莫特組的創面愈合時間較短，差異有統計學意義（P<0.05）；與凡士林組相比，咪喹莫特組的創面愈合用時更少（P<0.05）。各組實驗兔完全上皮化時間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。

3 討論

人體的組織損傷修復基本都通過瘢痕組織完成，增生性瘢痕為病理性瘢痕的一種，是機體過度修復的表現，不僅影響美觀，而且對于患者的身心健康也會造成影響。瘢痕的發病機制較為復雜、多樣，多種因素能夠對瘢痕創面的愈合產生影響，進而導致成纖維細胞的過度增生，形成增生性瘢痕，而瘢痕中通常聚集有大量的巨噬細胞、淋巴細胞等[7-9]。瘢痕增生主要由多種因素共同作用，免疫因素在其發生發展中可能發揮了十分重要的作用，而淋巴細胞有可能扮演著重要的角色。已有研究表明[10]，T淋巴細胞在增生性瘢痕的發生過程中發揮了重要作用。增生性瘢痕組織中有大量的異常增粗的膠原纖維束，T淋巴細胞的細胞凋亡與增殖平衡被打破，浸潤與成纖維細胞發生相互作用，成纖維細胞分泌纖維連接蛋白和膠原蛋白，當肉芽組織成熟后，大量膠原蛋白沉積于細胞外基質，加重這一過程[11]。咪喹莫特近年來在臨床的應用較為廣泛。咪喹莫特為人工合成的非核苷類異環咪唑喹啉胺類藥物，可被抗原遞呈細胞識別，主要通過Toll樣受體進行免疫識別調節，介導免疫識別，刺激相關免疫因子的合成，活化Thl細胞免疫途徑，增加Thl細胞相關細胞因子的合成，抑制Th2細胞因子的產生，抑制相關免疫反應，使免疫反應傾向于Th1細胞[12-13]。已有研究表明[4]，咪喹莫特能夠明顯控制瘢痕疙瘩的復發，且能夠改善瘢痕顏色以及硬度，療效較好，提示了咪喹莫特對于增生性瘢痕的抑制作用。本次實驗結果表明，與模型組相比，凡士林組以及咪喹莫特組的瘢痕增生指數較低，且咪喹莫特組瘢痕增生指數低于凡士林組，創面愈合時間較短。

T細胞能夠調節膠原纖維的沉積其中，Th細胞分化為Th0細胞，而Th0細胞又繼續分化為Th1細胞和Th2細胞等亞群，近年來的研究已經證實[14]，Th1、Th2細胞與纖維化的關系密切，Th1細胞能夠減輕纖維化而Th2細胞則會促進這一過程。其中Th1細胞主要產生干擾素-γ（IFN-γ）以及白介素-12（IL-12），其中IFN-γ通過抑制膠原的合成，具有促進膠原重構的作用，因此表現為減輕纖維化以及細胞外基質降解的作用。Th2細胞能夠產生包括白介素-4（IL-4），白介素-6（IL-6），白介素-10（IL-10）等在內的多種細胞因子，其中IL-4 能夠作用于成纖維細胞產生強促纖維化作用[15]。因此在增生性瘢痕的形成過程中，Th1細胞和Th2細胞相互作用，研究證實Th2細胞發揮主導作用[16]，單獨改變Th1細胞或者Th2細胞中的細胞因子對于增生性瘢痕的治療并無治療作用，猜測可能受到了來自全身免疫細胞的調節，因此免疫細胞與病變局部細胞相互作用的上游，即趨化因子的水平與病理性瘢痕的形成關系密切。因此近年來學者將研究的重點放在Th1、Th2細胞相關趨化因子上。

趨化因子是由局部組織產生的具有化學趨化活性的一族蛋白質[17]。免疫細胞表面均有趨化因子受體，當受體與趨化因子結合時，免疫細胞就會在其作用下發生遷移。因此Th1、Th2細胞在相應的趨化因子的作用下，被遷移至創傷組織，進而產生相關細胞因子，參與增生性瘢痕的形成。研究證實[18]，局部組織趨化因子的水平可以影響Th1、Th2細胞的水平。其中趨化因子CXCL10以及CXCL12為Th1細胞表面的趨化因子，其中CXCL12炎癥反應中發生選擇性趨化Th1細胞。能夠參與Th1介導的細胞免疫反應。CCL2、CCL3、CCL5、CCL7、CCL13是Th2細胞的相關趨化因子。研究表明[16]，在瘢痕的增生過程中，Th2的相關趨化因子水平增高，而Th1細胞相關趨化因子水平均較低，Th2細胞發揮主導作用。本次實驗結果表明，與正常空白組實驗兔相比，各組的Th1細胞相關趨化因子CXCL10、CXCL12水平均較低，Th2細胞相關趨化因子CCL2、CCL3、CCL5、CCL7、CCL13水平均較高。與模型組相比，凡士林組以及咪喹莫特組的Th2細胞相關趨化因子水平較低，Th1細胞相關趨化因子水平較高；與凡士林組相比，咪喹莫特組的Th2細胞相關趨化因子水平較低，Th1細胞相關趨化因子水平較高，表明本實驗措施能夠糾正在瘢痕增生過程中Th2細胞反應的主導地位，抑制Th2細胞反應，增加瘢痕局部組織的Th1細胞，增強Th1細胞反應，從而減輕瘢痕局部的膠原沉積，減輕纖維化。

綜上，本實驗通過探討咪喹莫特調節Th1、Th2細胞相關趨化因子對兔耳增生性瘢痕創面愈合時間和瘢痕增生的影響，證實了咪喹莫特能夠調節Th1、Th2細胞相關趨化因子，縮短兔耳增生性瘢痕創面的愈合時間。有助于闡明瘢痕增生的機制，在下一步研究中，將對本實驗的結論作更深入的論證。

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[收稿日期]2018-01-20 [修回日期]2018-02-28

編輯/朱婉蓉