M2型巨噬細胞在卵巢癌患者腹膜內腫瘤血管生成中的作用

降禮均

（內江市第二人民醫院，四川 瀘州 641000）

卵巢癌是女性常見的生殖系統惡性腫瘤。該病起病較為隱匿，大多數該病患者在就診時已處于病程的晚期[1]。近年來的研究表明，卵巢癌患者體內M2型巨噬細胞的浸潤數量與其預后存在密切的關聯[2-3]。在本次研究中，筆者通過對卵巢癌患者腹水中M2型巨噬細胞和內皮血管的相關性進行研究，探討M2巨噬細胞在卵巢癌患者腹膜內腫瘤血管生成中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

人單核白血病細胞株、EA.hy926人臍靜脈細胞融合細胞株由上海中科院提供；胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）、DMEM培養液、平衡鹽溶液（HBSS）及細胞培養基RPMI 1640由GIBCO公司提供；丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）試劑由Sigmg公司提供；結晶紫染色試劑由碧云天生物技術公司提供；Transwell遷移小室由Corning公司提供；酶聯免疫吸附實驗（ELISA）的試劑盒由R&D公司提供；Matrigel基質膠由BD公司提供。

1.2 方法

1.2.1 進行細胞培養 取EA.hy926細胞，將其放入濃度為10%的FBS-RPMI 1640培養液中，然后將該培養液置于37℃的培養箱中，待細胞生長至對數期后對其進行消化收集。

1.2.2 進行細胞分化 將濃度為10%的FBS-RPMI 1640培養液重懸細胞至1×106個/ml，向其中加入PMA試劑，將其濃度調整為320 nmol/L后刺激24 h，使細胞分化為巨噬細胞樣細胞（TAP）。待細胞貼壁后，去除上清液，使用鹽酸緩沖鹽溶液（PBS）對細胞進行充分的潤洗，然后向其中加入濃度為10%的FBS-RPMI 1640培養液進行24 h的培養，再次去除上清液，并使用無血清的FBS-RPMI 1640培養基進行24 h的刺激培養。收集上清液，將其作為條件培養基（PMAr CM）。

1.2.3 進行巨噬細胞分離 取7例卵巢癌患者的腹水（在其進行手術的過程中用無菌技術進行采集）。對腹水樣本進行常規的離心處理（轉速為1200 r/min，處理時間為15min），收集細胞沉淀，然后用Ficoll密度梯度法（轉速為2000 r/min，處理時間為20 min）收集中間層單核細胞。用HBSS對中間層單核細胞進行重懸后，再對其進行離心處理，然后用濃度為5%的FBS-RPMI 1640對其進行重懸，將其種植在24孔板上，種植的密度為每孔1×106。將24孔板在培養箱內靜置4 h，使細胞貼壁，然后用經過預熱的HBSS對細胞進行3次潤洗，去除懸浮細胞。向培養箱中加入濃度為10%的FBS-RPMI 1640培養液，進行24 h的靜置培養后，收集上清液，將其作為條件培養基（M2 CM）。

1.2.4 進行內皮細胞增殖能力（OD值）、遷移數目及腫瘤血管生成數量檢測 將生長至對數期的EA.hy926細胞種植在96孔板上，靜置8 h，待細胞貼壁后，去除上清液，向其中加入DMEM培養液，并對細胞進行12 h的同步處理，使參與實驗的所有細胞均處于相同的增殖時相。將細胞分別加入以下四組培養基中，并進行48 h的培養：1）DMEM培養基組，將其作為參考組。2）M2 CM組（即M2巨噬細胞的無血清培養上清），將其作為A組。3）PMAr CM 組（即TAP細胞的無血清培養上清），將其作為B組。4）腹水組（在術中收集卵巢癌患者的腹水，經離心處理、清除沉淀及培養后，取上清液待檢），將其作為C組。分別采用結晶紫染色、Transwell小室遷移及小管樣結構形成實驗對上述四組培養基中內皮細胞的OD值、遷移數目及小管形成的數量進行檢測，并對比檢測的結果。

1.2.5 進行VEGF及IL-8含量檢驗 用ELISA法對上述四組培養基中VEGF及IL-8的分泌情況進行檢驗，對比這四組培養基中VEGF及IL-8的含量。

1.3 統計學分析

將本次研究中的數據均納入SPSS20.0統計軟件進行分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 四組不同的培養基中內皮細胞的OD值、遷移數目及小管形成數量的對比

與參考組相比，A組、B組及C組內皮細胞的OD值、遷移數目及小管形成的數量均較高，P＜0.05。詳見表1。

表1 四組不同的培養基中內皮細胞的OD值、遷移數目及小管形成數量的對比 （ ±s）

表1 四組不同的培養基中內皮細胞的OD值、遷移數目及小管形成數量的對比 （ ±s）

注：a與參考組相比，P＜0.05。

組別 OD值 遷移數目 小管形成數量A組 0.195±0.001a 85.02±1.98a 11.74±0.53a B 組 0.211±0.012a 72.77±6.51a 11.63±0.68a C 組 0.227±0.013a 144.98±10.62a 10.31±0.79a參考組 0.168±0.004 10.24±0.31 5.09±1.05

2.2 四組不同的培養基中IL-8及VEGF分泌量的對比

A組、B組培養基中的EA.hy926細胞分泌IL-8、VEGF的量均明顯高于參考組，C組培養基中的EA.hy926細胞分泌IL-8的量也高于參考組，P＜0.05。不過，C組培養基中的EA.hy926細胞分泌VEGF的量與參考組相比，P＞0.05。詳見表2。

表2 四組不同的培養基中IL-8及VEGF分泌量的對比 （ ±s）

表2 四組不同的培養基中IL-8及VEGF分泌量的對比 （ ±s）

注：a與參考組相比，P＜0.05。

指標 培養基 參考組 A組 B組 C組IL-8（ng/L） M2 CM 10.34±5.36 88.62±24.68a 86.76±2195a 36.74±15.62a PMAr CM 104.34±25.74 1673.14±267.61a 1527.62±229.75a 684.62±96.36a VEGF（ng/L） M2 CM 9.97±4.29 34.62±15.62a 1374.62±184.74a 12.36±5.16 PMAr CM 111.64±19.65 486.67±42.98a 1112.36±59.74a 168.34±24.62

3 討論

巨噬細胞是腫瘤組織微環境中的一種非常重要的炎癥細胞，其含量約占瘤間質炎癥細胞總量的30%～50%[4]。該細胞來自外周血單核細胞，可在特定的微環境下分化成M2型巨噬細胞，且可釋放IL-8、IL-4、TNF-a、EGF、IL-10及TGF-β1等多種因子及基質金屬蛋白酶[5-6]，故其在腫瘤的進展中具有重要的作用。腫瘤血管生成是指在各種因子的刺激和誘導下，腫瘤組織中成熟血管的內皮細胞發生增殖、游走，并生成小血管，從而加快腫瘤的侵襲與轉移。而內皮細胞的遷移和增殖是小血管生成的基礎。

本次研究的結果顯示，A組、B組、C組內皮細胞的OD值、遷移數量及小血管的生成數量均高于參考組，P＜0.05。這說明，M2型巨噬細胞可提高內皮細胞的增殖、遷移能力及腫瘤血管的生成能力。而且，A組、B組培養基中的EA.hy926細胞分泌IL-8、VEGF的量均明顯高于參考組，C組培養基中的EA.hy926細胞分泌IL-8的量也高于參考組，P＜0.05。這說明，M2巨噬細胞可通過增加IL-8及VEGF的分泌量來加快腫瘤血管的生成。

綜上所述，卵巢癌患者腹水中的M2型巨噬細胞可通過調控內皮細胞分泌IL-8及VEGF等促血管生成因子，增加內皮細胞的增殖、遷移能力和腫瘤血管的生成能力，從而促進患者腹膜內腫瘤血管的生成。這一研究結果有助于臨床上進一步了解卵巢癌患者腹膜微環境中的炎癥細胞和腫瘤血管生成的相互作用，從而為開展卵巢癌的靶向治療提供依據。

參考文獻

[1]王晨旭,王麗麗,楊艷芹,等.卵巢癌、成熟型畸胎瘤與正常血液樣本中揮發性組分的研究[J].分析化學,2015,43(6):919-923.

[2]宋玉霞,趙濤,王宏衛,等.卵巢癌腹水中不同腫瘤相關性巨噬細胞亞型IL-10、IL-12表達的差異[J].河北醫科大學學報,2017,38(6):676-679.

[3]李喬,尹如鐵,周樂,等.IL-10免疫黏附素和腫瘤相關巨噬細胞對卵巢癌侵襲性的研究[J].華西藥學雜志,2017,32(3):257-259.

[4]柯星,張淑平,吳夢,等.腫瘤相關M2型巨噬細胞通過Toll樣受體增強卵巢癌細胞MMP-9的表達[J].基礎醫學與臨床,2014,34(10):1315-1320.

[5]黃福海,潘麗英,徐楚燕,等.腫瘤相關巨噬細胞與卵巢癌組織之間的關系及預后的影響[J].中國醫藥科學,2016,6(5):166-168,175.

[6]汪洪,鄧凱賢,鄭玉華,等.卵巢癌組織與腫瘤相關巨噬細胞之間的關系及預后的影響[J].中國醫藥科學,2016,6(23):220-222.