異煙肼-柚皮素共晶的表征及其性能研究

梁文懂，羅 春，張海祿，張春桃

(1.武漢科技大學煤轉化與新型炭材料湖北省重點實驗室，湖北 武漢,430081; 2. 中國科學院蘇州納米技術與納米仿生研究所，江蘇 蘇州,215123)

異煙肼(Isoniazid，INZ)是目前廣泛用于各型肺結核治療的首選藥物[1]，水溶性好(183 mg/mL, pH=7.5)[2]，但在用藥時會引起諸多不良反應，特別是生成大量親電子基、氧自由基等活性代謝產物，耗竭肝內谷胱甘肽(GSH)，造成肝損傷[3]，嚴重時甚至導致必須停止用藥[4]。柚皮素(Naringenin，NAR) 是一種黃酮類天然產物，能夠抑制脂肪肝形成過程中自由基的產生，增強對Hep G2細胞氧化應激的緩解作用，減弱肝損傷[5]，并可使CCl4所致急性肝損傷過程中的氧化應激反應減輕,顯著降低肝細胞核DNA單鏈斷裂氧化損傷水平[6]，因而有望在降低肝損傷方面得到應用。但由于柚皮素的溶解度很低(46±6 μg/mL，298 K)，客觀上導致其生物利用度相當低[7-8]。

近年來，藥物共晶在改善藥物的理化性質方面得到了廣泛應用[9]。藥物共晶可在不改變藥物分子結構的同時，改善藥物的理化性質，因而在藥物研發中具有很高的應用價值。柚皮素的結構和性質均適宜與異煙肼形成共晶，有鑒于此，本文通過混懸法制備了異煙肼-柚皮素的藥物-藥物共晶，考察了柚皮素的多羥基結構與異煙肼上的吡啶氮和酰肼基團間的氫鍵作用，確定了共晶中異煙肼和柚皮素的比例，測定了原料以及共晶的表觀平衡溶解度，分析了共晶產物中異煙肼和柚皮素平衡溶解度的變化對肝損傷以及對護肝作用的影響，以期為解決異煙肼所導致的肝損傷問題提供借鑒，并為異煙肼的共晶研究提供參考。

1 實驗

1.1 試劑和儀器

異煙肼 (純度不低于98%)；柚皮素(純度不低于97%)；甲醇、乙醇、甲苯、乙腈(分析純)。德國Bruker公司D8 ADVANCE粉末X射線衍射儀；美國TA Instruments公司Q2000差示掃描量熱儀；美國Thermo Fisher傅里葉變換紅外光譜儀；美國Varian公司Varian 400液態核磁共振儀；德國Bruker公司ADVANCEⅢ-500固態核磁共振儀；美國Wtaers2535高效液相色譜儀，PDA檢測器；RC-6溶出度測試儀。

1.2 共晶的制備

分別稱量137 mg異煙肼和272 mg柚皮素于20 mL凍干瓶中，加入5 mL甲醇/甲苯(體積比為1∶1)混合溶劑作為混旋液，在室溫下磁力攪拌72 h后離心分離，除去上層清液，下層離心產物置于烘箱中，40 ℃烘干12 h即得共晶樣品。

1.3 共晶的分析與表征

粉末X射線衍射(XRPD)：銅靶作為X射線源，工作電壓40 V,電流40 A，粉末樣品的掃描步長為0.02°，掃描角度范圍為3°～40°，每步停留時間17s；差示掃描量熱(DSC)：N2流速50.0 mL/min，加熱速率5 ℃/min；傅里葉變換紅外光譜(FTIR)：粉末樣品用溴化鉀壓片后測試，掃描波數范圍為400～4000 cm-1，掃描次數100，分辨率4 cm-1；固態核磁共振(SSNMR)：在11.7 T的場強下，用4 mm雙共振魔角旋轉探頭采集固態下13C的交叉極化/魔角(CP/MAS)譜圖，譜圖采集條件：旋轉速度為8 kHz MAS，接觸時間為2 ms，13C化學位移參考值為四甲基硅烷(TMS,δ=0)；液態核磁共振(LNMR)：取5 mg左右樣品溶解于氘代二甲基亞砜后進行掃譜，以四甲基硅烷(TMS，δ=0)為內標。

1.4 表觀平衡溶解度測試

分別稱量20 mg柚皮素、2000 mg異煙肼以及500 mg共晶樣品，置于10 mL凍干瓶中，分別加入5 mL、 pH=1.2的鹽酸溶液(模擬胃液)和pH=6.8的磷酸緩沖液(模擬腸液)。通過熱臺精確控溫到37 ℃，并控制磁力攪拌轉速為350 rpm，連續攪拌72 h后，抽取懸濁液，采用0.22 μm 的水系濾膜過濾并立刻用超純水稀釋。其中，柚皮素樣品稀釋5倍，異煙肼樣品稀釋1000倍，共晶樣品稀釋100倍。稀釋液通過高效液相色譜檢測其濃度。色譜條件為：固定相，C18反相柱(GraceSmart RP C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相，甲醇-水(體積比為1∶1)，流速為1 mL/min,柱溫37 ℃。每個實驗進行3次取平均值。未溶解的殘渣通過濾紙過濾收集，經40 ℃烘箱干燥，通過粉末XRD確定其物相組成。

2 結果與分析

2.1 XRPD分析

原料異煙肼、柚皮素和共晶產物的XRPD圖譜如圖1所示。由圖1可見，共晶的XRPD譜圖在2θ為4.34°、8.60°、21.64°、26.70°等處出現新的特征峰，其中柚皮素在15.82°、17.28°、20.04°、22.46°、23.83°、24.57°、25.51°、27.82°等處的主峰都消失，異煙肼在11.92°、14.28°、15.61°、16.79°、25.26°、26.20°等處的主峰幾乎全部消失，由此可見柚皮素和異煙肼之間確實形成了共晶。

圖1 異煙肼、柚皮素和共晶的粉末XRD圖譜

2.2 DSC分析

原料異煙肼、柚皮素和共晶產物的DSC譜圖如圖2所示。異煙肼和柚皮素的熔點分別為173.3 ℃和254.1 ℃，混懸產物的熔點為227.4 ℃，不同于任何一種原料，表明該產物為完全不同于原料的新相，這是典型的共晶形成的熱力學標志。共晶的DSC只有一個特征熔融峰并沒有原料的熔融峰，表明通過混懸制備的共晶樣品晶相很純。

圖2 異煙肼、柚皮素和共晶的DSC圖譜

2.3 FTIR分析

圖3 異煙肼、柚皮素和共晶的FTIR圖譜

2.4 SSNMR分析

通過密度泛函理論(DFT)計算，對兩種原料和共晶的SSNMR圖譜中碳峰進行了歸屬，結果如圖4所示。由圖4可以看出，共晶中的每個碳峰均為單峰，說明在一個不對稱單元里Z′=1，表明共晶的摩爾計量比為1∶1。異煙肼原料中酰肼基C(11)的化學位移為166.62，在形成共晶后變為 169.18，吡啶氮兩側的C(14)、C(15)的化學位移則由149.19、151.42合并為共晶后的148.51；柚皮素在δ為166.86、165.31、153.41處的峰分別歸屬于C(5)、C(7)和C(4)的碳峰，在形成共晶后化學位移分別變為169.18、163.75、158.02。這些碳原子化學環境變化表明，異煙肼上的酰肼基和吡啶氮與柚皮素O(4)H、O(5)H、O(3)H三個羥基之間形成新的氫鍵作用，這與FTIR的結果一致。

圖4 異煙肼、柚皮素和共晶的13C固態核磁共振圖譜

Fig.4CP/MASTOSSNMRspectraofINZ,NARandcocrystal

2.5 LNMR分析

液態核磁共振氫譜是確定共晶分子間計量比最直觀且有效的方法。異煙肼、柚皮素和共晶的LNMR氫譜如圖5所示。圖5中，RI表示氫峰的相對積分面積；NH表示異煙肼或柚皮素的各氫原子數目。由圖5可見，共晶LNMR氫譜中的氫峰是兩種原料氫峰的疊加，柚皮素與異煙肼的摩爾計量比為1∶1，與固態核磁共振所得出的結果相一致。

圖5 異煙肼、柚皮素和共晶的液態核磁共振氫譜

2.6 表觀平衡溶解度分析

異煙肼、柚皮素以及共晶在模擬生理液中的表觀平衡溶解度如圖6所示。由圖6(a)可見，在pH=1.2的鹽酸溶液和pH=6.8的磷酸緩沖液中，異煙肼的平衡溶解度分別為264 mg/mL和190 mg/mL，溶解度太大，容易在代謝過程中產生過量的親電子基、氧自由基，人體沒有足夠谷胱甘肽(GSH)與之結合解毒，這正是其造成肝損傷的重要原因。異煙肼在與柚皮素形成共晶以后，在兩種pH值條件下其溶解度分別減小到20.8 mg/mL和0.74mg/mL，分別降低為原來的7.9%和0.39%，意味著在同等給藥條件下，異煙肼的肝損傷會大大減小。由圖6(b)可見，柚皮素在與異煙肼形成共晶以后，在pH=1.2的介質中，其平衡溶解度從0.044 mg/mL提高到0.064 mg/mL；在pH=6.8的介質中，則由0.061 mg/mL提高到0.227mg/mL，分別提高到原來的1.45倍和3.72倍。柚皮素溶解度的提高意味著其清除自由基和親電子基的能力的提高，從而提高護肝的功效。異煙肼、柚皮素和共晶溶解前后的粉末XRD圖譜如圖7所示。由圖7可以看出，異煙肼和柚皮素在兩種介質中達到溶解平衡后的殘渣仍為原料異煙肼和柚皮素，沒有發生相轉化；圖7(a)顯示，共晶在pH=1.2介質中部分發生了裂解，殘渣中既有共晶，也有柚皮素；圖7(b)則表明，在pH為6.8的介質中，共晶沒有發生裂解，殘渣依然是共晶。

(a)異煙肼INZ

(b)柚皮素NAR

Fig.6ApparentequilibriumsolubilityofINZ,NARandcocrystal

(a)pH=1.2

(b)pH=6.8

Fig.7XRPDpatternsofINZ,NARandcocrystalbeforeandafterdissolutionexperiment

3 結論

(1)選用柚皮素作為共晶前驅體，以甲醇和甲苯的混合溶劑作為混旋懸液，可制備得到異煙肼-柚皮素的藥物-藥物共晶，共晶產物中異煙肼與柚皮素的摩爾比為1∶1，異煙肼的酰肼基團和吡啶氮與柚皮素上三個羥基形成了氫鍵。

(2)在pH值為1.2和6.8的兩種模擬生理

液中，共晶產物中柚皮素相比純柚皮素的平衡溶解度分別提升到原料的1.45倍和3.72倍，而共晶產物中異煙肼的平衡溶解度分別為純異煙肼的7.9%和0.39%，表明在同等給藥量的條件下，柚皮素的抗氧化、清除自由基、保肝護肝功效得到提高，同時異煙肼所致的肝損傷也會大幅減低，這種共同作用能夠進一步強化保肝護肝的功效，藥理作用明顯。

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