LC3B、HDAC6和Nrf2在慢性阻塞性肺疾病急性加重患者外周血中的表達

盛 青，謝 貝，劉志輝，馬志明，譚俊豪

慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)，是一種以持續氣流受限為特征的可以預防和治療的嚴重危害人類健康的疾病，氣流受限多呈進行性發展，至2020年慢阻肺將居全球患者疾病死亡原因的第三位[1]。目前臨床上慢阻肺的確切病因尚不明確，但多數人認為包括多種致病機制，如氧化應激、炎癥反應和細胞凋亡等[2-4]，而近年來有許多研究顯示自噬作用也參與了慢阻肺的發生發展過程[5-7]。

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)主要的改變是氣道對香煙煙霧(CS)的異常炎癥反應，這一炎性變化與氣道上皮細胞功能失調、纖毛縮短和粘液纖毛清除障礙有關[8]。在LC3B敲除小鼠和這些小鼠來源的氣管上皮細胞中，CS誘導的自噬水平下降，且纖毛縮短程度也減輕。組蛋白脫乙酰酶6 (HDAC6)是組蛋白去乙酰化酶(histone deace-tylases，HDACs)家族成員之一，是細胞內CS暴露期間自噬介導的纖毛縮短的重要調節因子，在HDAC6敲除小鼠和這些小鼠來源的氣管上皮細胞中，CS誘導的自噬水平也下降以及纖毛縮短程度減輕[9]，其機制可能是通過去乙酰化作用介導LC3B的乙酰化修飾，進而促進自噬降解。而在自噬的信號通路中，LC3B已被證明受到乙酰化修飾的調控,進而影響其催化活性的發揮。另外，在LC3B和HDAC6敲除小鼠中，CS誘導的粘液纖毛清除障礙程度也更輕，而在Nrf2敲除小鼠中，CS誘導的粘液纖毛清除障礙程度更重[10]，且Nrf2能夠調節CS誘導的LC3B表達，而且Nrf2是活性最強的轉錄調節因子。因此，在自噬的信號通路中，HDAC6能夠調控LC3B的乙酰化修飾，促進自噬降解，且Nrf2能夠調節LC3B的表達，進而調節自噬的形成，但其機制仍不清楚，有待進一步研究。

本文通過qRT-PCR檢測慢性阻塞性肺疾病急性加重(acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD)患者外周血單個核細胞中LC3B、HDAC6和Nrf2的表達水平，并分析其與外周血白細胞總數、單核細胞百分比、淋巴細胞百分比及中性粒細胞絕對值的相關性，探討自噬相關基因LC3B、HDAC6和Nrf2在AECOPD的發生發展中的作用。

1 資料和方法

1.1 研究對象 收集2016年9月至2017年5月在廣州市胸科醫院呼吸科住院的AECOPD患者36例，其中男性28例，女性8例，年齡47-85歲，所有COPD患者的診斷標準均符合2013年中華醫學會呼吸病學分會制定的《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版)》。慢阻肺急性加重是指患者呼吸道癥狀超過日常變異范圍的持續惡化，并需改變藥物治療方案，在疾病過程中，患者常有短期內咳嗽、咳痰、氣短和(或)喘息加重，痰量增加，膿性或粘液膿性痰，可伴有發熱等炎癥明顯加重的表現[1]。本研究經廣州市胸科醫院醫學倫理委員會審核批準，所有患者簽署知情同意書。納入同期健康體檢者21名為對照組，其中男性12名，女性9名，年齡43歲-78歲。

1.2 臨床樣本處理 分別收集慢阻肺急性加重患者及健康組外周血5mL至EDTA抗凝管中，用于分離外周血單個核細胞。取5mL PBS稀釋外周血，將5mL的淋巴細胞分離液置于15 mL管底，緩慢地將稀釋血液加入至分離液上，輕輕放置離心機中，2000 rpm，升速1，降速9，離心15 min，取中間白色層，2000 rpm離心5 min，留取白色沉底。

1.3 qRT-PCR檢測 根據Total RNA Kit I說明書抽提總RNA(OMEGA公司)；RNA濃度和A260/280比率由紫外分光光度儀檢測；通過PrimeScript?RT kit反轉錄成cDNA(TAKARA公司)；qPCR由SYBR Green PCR Master Mix按照標準步驟操作(上海美吉生物醫藥科技有限公司)；所有基因的mRNA與管家基因GAPDH以2-ΔΔCT函數值進行計算。

1.4 采用Graphpad prism 5.0進行分析，非配對t檢驗計算兩組間差異，Pearson用于相關性分析，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 LC3B、HDAC6和Nrf2在外周血單個核細胞中的表達水平比較

檢測外周血LC3B、HDAC6和Nrf2的基因表達水平，結果發現AECOPD患者外周血單個核細胞LC3B的表達水平(4.336±0.6328)明顯高于健康對照(1.000±0.1522)，兩者間差異具有統計學意義(P=0.0002)；HDAC6的表達水平(3.756±0.4612)明顯高于健康對照(1.000±0.05988)，兩者間差異具有統計學意義(P<0.0001)；同時Nrf2的表達水平(0.1786±0.01333)明顯低于健康對照(0.8094±0.1111)，兩者間差異具有統計學意義(P<0.0001)(見圖1)。

圖1： 健康組和AECOPD外周血單個核細胞LC3B、HDAC6和Nrf2的表達水平比較

2.2 AECOPD患者外周血LC3B、HDAC6和Nrf2的表達水平與白細胞總數、單核細胞百分比、淋巴細胞百分比及中性粒細胞絕對值的相關性分析

Pearson相關性分析如表1所示，AECOPD患者外周血LC3B的表達水平與白細胞總數呈正相關(r=0.5559，P=0.0314)，Nrf2的表達水平與白細胞總數無相關性(r=0.3909，P=0.1670)，同時LC3B的表達水平與中性粒細胞絕對值呈正相關(r=0.5968，P=0.0188)；HDAC6的表達水平與單核細胞百分比無相關性(r=0.2944，P=0.2684)，Nrf2的表達水平與單核細胞百分比呈負相關(r=-0.7531，P=0.0019)；LC3B和HDAC6的表達水平與淋巴細胞百分比無相關性(r=-0.3795，P=0.1630；r=0.3360，P=0.2032)，Nrf2的表達水平與淋巴細胞百分比呈負相關(r=-0.5819，P=0.0370)。

3 討 論

隨著環境等的變化，慢阻肺的患者人數日益增加，其中吸煙是重要的因素，因此提高人的環境保護意識及加強人們對吸煙危害的認識顯得尤為重要。而在臨床方面，如何預防和更好地治療該疾病是目前一個迫切需要解決的問題，因此弄清楚其發病機制，有利于及時發現和治療慢阻肺病人。

表1 AECOPD患者外周血LC3B、HDAC6和Nrf2的表達水平與白細胞總數、單核細胞百分比、淋巴細胞百分比及中性粒細胞絕對值的相關性分析

自噬可能影響人類疾病的進展，在調節細胞器內的穩態，蛋白質的周轉，炎癥反應，以及先天和適應性免疫反應中具有多種作用。大量的研究工作表明自噬在慢阻肺發病機制中的具有重要角色，從慢阻肺患者臨床標本中也觀察到自噬蛋白和自噬體數目的增加[11]。此外，有研究發現敲除自噬蛋白的基因后可以抑制慢性CS誘導的小鼠肺氣腫的發展。

在自噬形成的過程中,多種自噬相關基因(autophagy-relatedgene,Atg)參與自噬泡的形成，其中微管相關蛋白1輕鏈3 (LC3)修飾過程對自噬泡的形成必不可少，與自噬泡的形成息息相關。研究表明，自噬蛋白LC3參與氣道上皮自噬體的形成[10]。在慢阻肺病人中，自噬水平升高，LC3B-I表達水平下降，而LC3B-Ⅱ的表達增加，同時研究還發現LC3B在香煙誘導的細胞凋亡及肺氣腫發展中具有重要的作用[11]。Zhu等[12]發現，香煙抽提物(CSE)能增加氣道上皮細胞LC3B-II的表達及及吞噬小體的形成。但LC3B在慢阻肺急性加重患者外周血中的表達情況未見報道，為此我們研究了LC3B在AECOPD患者外周血中的表達水平并分析其與外周血白細胞總數和中性粒細胞絕對值的相關性。結果顯示，LC3B在AECOPD患者外周血中的表達水平明顯增加，同時與外周血白細胞總數和中性粒細胞絕對值均呈正相關，進一步論證了在慢阻肺患者的急性加重期，自噬水平是增加的；同時可能介導炎癥細胞的增殖、遷移等炎癥反應，可作為觀察病情變化的一個分子指標。

在自噬的信號通路中，LC3B已被證明受到乙酰化修飾的調控,進而影響其催化活性的發揮，而組蛋白去乙酰酶6(HDAC6)是組蛋白去乙酰化酶蛋白家族成員之一，其研究時間最長，它的作用是通過去乙酰化作用促進細胞質基板如微管蛋白的細胞遷移等[13]。Lam[14]等發現細胞內HDAC6是吸煙暴露期間自噬介導氣道纖毛縮短的一個關鍵因子。具有HDAC6(HDAC6-/Y)的X染色體缺失小鼠以及這些鼠的MTECs自噬水平低下，防御CS誘導的纖毛變化不明顯。上述結果表明，HDAC6是氣道上皮自噬反應過程中的重要因子。而我們的研究中發現HDAC6在AECOPD患者外周血中的表達水平明顯增加，表明HDAC6在COPD的急性加重期間可促進自噬的形成，并通過相關性分析，發現其可能與炎癥反應的形成密切相關。

Nrf2是CNC(cap’n’collar)轉錄因子家族成員中活力最強的轉錄調節因子，主要表達于如肝臟、腎臟等代謝和解毒組織中，以及其它持續暴露在環境中的組織如皮膚、肺、消化道等。與Nrf2+/+小鼠相比，長期暴露于香煙煙霧(4或6個月)的Nrf2-/-小鼠，將導致細胞自噬增加并抑制自噬相關蛋白的表達，形成更嚴重的肺氣腫癥狀[15]，表明Nrf2可能是氣道上皮自噬反應重要的調節子。而我們研究也發現Nrf2在AECOPD患者外周血中的表達水平明顯下降，同時AECOPD患者外周血Nrf2的表達水平與外周血單核細胞百分比和淋巴細胞百分比均呈負相關，表明Nrf2在COPD的急性加重期可抑制自噬體的形成，并進一步抑制其炎癥程度，同時也提示Nrf2可能調節AECOPD患者的免疫過程。

我們的這一研究表明，LC3B可與HDAC6和Nrf2一起作為觀察AECOPD患者病情的分子標志物。從另一方面，也為我們預防和治療慢阻肺提供了思路，我們或許可以利用分子靶向治療的方法調節LC3B、HDAC6和Nrf2的表達水平，從而調節患者的自噬活性，抑制患者的炎癥反應，最終達到治療的目的。

由于本次的實驗樣本數量較少，不能全面地揭示自噬相關基因在慢阻肺急性加重發生發展中的具體作用，但創新性地發現慢阻肺急性加重患者的炎癥反應與外周血LC3B、HDAC6、Nrf2的表達密切相關，為今后研究慢阻肺提供了新的思路。我們后續也將進一步對其作用機制做出研究，以確保得出最準確的結果。

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