再造丸質量標準研究

程似錦，李 恒

（1.長江職業學院生物醫藥學院，湖北 武漢 430064； 2.武漢藥品醫療器械檢驗所，湖北 武漢 430075）

再造丸，原方為《圣濟總錄·牛膝木瓜丸》之化裁方，是由秦艽、續斷等14味中藥材經粉碎后加入蜂蜜以水泛丸制成的純中藥復方制劑，能祛風止痛、除濕舒筋，用于風濕痹證引起的關節疼痛、肢體麻木、行履不健等癥。方中秦艽具有祛風濕、清濕熱之功效[1]，續斷補肝腎、強筋骨[2-3]，以固其本。為有效控制該藥品質量，本研究中建立了秦艽、續斷的薄層色譜定性鑒別法以及秦艽中龍膽苦苷的含量測定方法。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Ultimate 3000型高效液相色譜儀（包括DAD檢測器、UV檢測器，美國DIONEX公司）；色譜柱，戴安Acclaim 120 C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），Phenomenex Synergi柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），依利特 Hypersil BDS C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；CAMAG TLC VISUALIZER薄層色譜照相儀，BP211D電子天平（賽多利斯公司，感量 0.01 mg /0.1 mg）；硅膠 G 薄層板（青島海洋化工廠）。

1.2 試藥

龍膽苦苷對照品（批號110770-200712，純度以99.1%計），川續斷皂苷Ⅵ對照品（批號 111685-200802），秦艽對照藥材（批號 121199-200702），續斷對照藥材（批號121033-200608），均由中國食品藥品檢定研究院提供；甲醇為色譜純，水為超純水。5批樣品由某制藥有限公司提供（批號分別為B#05S-0809，B#05L-1009A，B#05L-1009B，B#05S-0306，B#05S-0306A）。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

秦艽[4-5]：取本品 5 g，研細，加硅藻土 5 g，加甲醇50 mL，加熱回流30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL，微熱使溶解，用乙酸乙酯振搖提取3次，每次25 mL，棄去乙酸乙酯液，水液再用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次25 mL，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次25 mL，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取秦艽對照藥材0.25 g，加甲醇20 mL，同法制成對照藥材溶液。再取龍膽苦苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。按處方比例、制備工藝制備缺秦艽的陰性對照品，按照供試品溶液方法制得。照薄層色譜法[2015年版《中國藥典(一部)》附錄ⅥB]試驗，吸取上述4種溶液各3～5 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠GF254薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（20 ∶2 ∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜和對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，分離度良好，陰性樣品（缺秦艽）無干擾。結果見圖1A。

續斷[5-6]：取秦艽鑒別項下供試品溶液作為供試品溶液。按處方比例，制備工藝制備缺續斷的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。另取續斷對照藥材0.25 g，加甲醇20 mL，同供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。再取川續斷皂苷Ⅵ對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2015年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述4種溶液各3～5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-醋酸-水（4∶1∶5）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照藥材和對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的主斑點，分離度良好，陰性樣品（缺續斷）無干擾。結果見圖1B。

圖1 薄層色譜圖

2.2 龍膽苦苷含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：戴安 Acclaim 120 C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 - 水（30 ∶70）；檢測波長：275 nm；流速：1.0 mL/min；理論板數按龍膽苦苷峰計算應不低于 3 000。柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2.2.2 溶液制備

對照品溶液：取龍膽苦苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含15 μg的溶液，即得。供試品溶液：取本品，研細，取1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過。精密量取續濾液5 mL置10 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續濾液，即得。陰性對照品溶液：按處方比例、制備工藝制備缺秦艽的陰性對照品，按照供試品溶液方法制得。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.2.2項下3種溶液，按上述色譜條件進行測定。結果表明，供試品溶液色譜中，在與龍膽苦苷對照品溶液色譜相同保留時間處有相應色譜峰，陰性對照品溶液色譜中無相應色譜峰。樣品中其他原輔料未對待測物的檢測產生干擾。對供試品溶液色譜中與龍膽苦苷溶液相同保留時間色譜峰進行DAD（190～400 nm）掃描，所得光譜圖與龍膽苦苷對照品相一致。詳見圖2。

線性關系考察：稱取龍膽苦苷對照品（純度99.1% ）9.96 mg，精密稱定，置 50 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取25 mL置50 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得到質量濃度為0.098 7 g/L的對照品貯備液。再分別精密量取上述對照品貯備液 1，5 mL 置 100 mL 容量瓶中；1.0，1.5，2.0，5.0，10.0 mL置10 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成質量濃度分別為 9.870×10-4g/L，4.935 × 10-3g /L，9.870 × 10-3g /L，1.481 × 10-2g /L，1.974 × 10-2g/L、4.935 ×10-2g/L、9.870 × 10-2g/L的對照品溶液。分別精密吸取上述系列對照品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定，以進樣量為橫坐標、峰面積積分值為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程 Y＝20.796 6 X-0.076 9，r＝ 0.999 9(n＝ 7)。結果表明，龍膽苦苷進樣量在 0.019 74 ～ 1.974 1 μg 范圍內與峰面積積分值線性關系良好。

精密度試驗：吸取質量濃度為 0.014 91 g/L的龍膽苦苷對照品溶液20 μL，連續進樣6次，以對照品峰面積計算精密度。結果的 RSD為 0.24%（n＝6），表明儀器精密度良好。在不同時間以不同的色譜柱將同批樣品依法制備供試品溶液，測定含量。結果3次測定平均含量為 1.39 mg/g，RSD ＝0.42%(n＝3)，表明方法中間精密度良好。

穩定性試驗：精密吸取同一供試品溶液20 μL，分別在 0，2，4，8，12 h 時進樣。結果平均峰面積值為5.783，RSD ＝0.62%(n＝5)，表明供試品溶液在 12 h內穩定性良好。

重復性試驗：取本品（批號B#05S-0809）9份（取樣量分別為 0.7，1.0，1.3 g 各 3 份），依法制備供試品溶液，測定。結果含量平均值為 1.378 mg/g，RSD ＝0.54%(n＝9)，表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密稱定已知含量的樣品（批號B#05S-0809，含量 1.378mg/g）0.5g，共取 6 份，分別置于具塞錐形瓶中，再精密量取50 mL質量濃度為0.014 91 g/L的對照品溶液6份，分別加入上述具塞錐形瓶中，再按照供試品溶液項下方法制備供試品溶液，測定并計算回收率。結果回收率在 97%～99%內，平均 98.11%，RSD＝0.44%(n＝6)，表明方法準確性較好。

圖2 專屬性試驗色譜圖和光譜圖

2.2.4 樣品含量測定

取5批樣品，依法測定含量。結果批號為B#05S-0809，B#05L-1009A，B#05L-1009B，B#05S-0306，B#05S-0306A的樣品中，龍膽苦苷含量分別為 1.38，1.34，1.32，0.70，0.73 mg /g。

3 討論

本品為水蜜丸，且加蜜量為30%，在定性鑒別中加適量硅藻土去除煉蜜，用乙酸乙酯去除脂溶性成分，從而有效減少了雜質干擾。對秦艽、續斷薄層色譜進行了展開溫度、濕度、不同廠家薄層板的考察，均分離良好，說明此方法可以作為其定性鑒別的方法。

2015 年版《中國藥典（一部）》中“秦艽”“龍膽”含量測定項下[5]，龍膽苦苷檢測波長分別為254 nm和270 nm。按照“2.2.1”項下色譜條件對龍膽苦苷對照品溶液進行測定，并做DAD（190～400 nm）掃描，所得光譜圖顯示龍膽苦苷在244，275 nm處有較大吸收，供試品色譜中龍膽苦苷在相應波長亦有較大吸收。對供試品溶液、對照品溶液在254 nm及275 nm同時做雙波長檢測，發現龍膽苦苷峰在275 nm波長所測響應值較254 nm高約20%，且供試品溶液色譜中雜質峰較少。參考其他文獻資料[7-10]，最終選擇275 nm為龍膽苦苷含量測定的檢測波長。

本研究中對提取方法，提取時間，提取溶劑的體積進行了考察[11-12]，結果加熱回流提取的龍膽苦苷含量較高，表明加熱回流提取效率更高；加熱回流30 min，1 h，2 h時提取的龍膽苦苷含量相當；25，50，100 mL提取的龍膽苦苷含量相當。故選擇甲醇50 mL加熱回流1 h作為提取方法。

本研究中建立了中藥成方制劑再造丸中秦艽、續斷的薄層色譜鑒別法，以及秦艽中龍膽苦苷的含量測定方法，為該制劑質量標準的制訂提供了方法和依據。

參考文獻：

[1] 蔡秋生，張志紅，高慧琴.秦艽藥理作用及臨床應用研究進展[J].甘肅中醫學院學報，2010，27（6）：55-58.

[2] 高秀芝，馬魯豫，金艷霞，等.川續斷化學成分及藥理作用研究進展[J].亞太傳統醫藥，2010，6（7）：142-146.

[3] 劉二偉，吳 帥，樊官偉.川續斷化學成分及藥理作用研究進展[J].中華中醫藥學刊，2010，20（7）：1421-1423.

[4] 曹 雯.秦艽的薄層色譜分析[J].時珍國醫國藥，2003，26（12）：746-747.

[5] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015：270.

[6] 郭征兵，徐 倩.生龍接骨膠囊薄層色譜鑒別[J].江西醫藥，2010，11（6）：585.

[7] 付成國，朱靖平，白 冰，等.靈龍感冒膠囊中龍膽苦苷的含量測定[J]中國中醫藥信息雜志，2011，18（6）：56-57.

[8] 王 琳，段寶忠，聶茜茜，等.高效液相色譜法測定云南產龍膽習用品頭花龍膽中3種成分的含量[J].醫藥導報，2015，34（4）：515-516.

[9] 陳岳蓉，劉海青，蘇東敏.HPLC法同時測定骨刺消痛膠囊中落干酸和龍膽苦苷的含量[J].藥物分析雜志，2009，28（7）：1169-1171.

[10] 吳美香，高洪琳，張 霞，等.骨筋丸膠囊中秦艽的龍膽苦苷的檢測研究[J].中國藥品標準，2011，12（3）：202-205.

[11] 楊 帆，鐘桂雄，趙洪普，等.不同方法提取淫羊藿苷的正交試驗研究[J].中國藥房，2005，16（6）：16-18.

[12] 朱 英，裘德勝，陳 民，等.金銀花葉總黃酮的水提取工藝研究[J].中成藥，2007，29（1）：60-63.