雞傳染性支氣管炎病毒N蛋白的表達及ELISA診斷試劑盒的研制與應用

亓麗紅，黃 兵，吳家強，宋玲玲，王友令，馬秀麗，于可響，劉 濤，艾 武，徐懷英

(山東省農(nóng)業(yè)科學院 家禽研究所，山東 濟南 250023)

雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起雞急性高度接觸性傳染病，以呼吸道癥狀、蛋種雞產(chǎn)蛋量下降、蛋品質(zhì)下降、腎臟病變及胃腸炎變化為主要特征，是目前危害國際養(yǎng)禽業(yè)的主要疾病之一。由于IBV血清型多，且新的血清型不斷涌現(xiàn)，而各型間交叉保護率低，新的變異株不斷出現(xiàn)，組織嗜性也多變，給診斷和防治帶來一定困難[1-5]。

IBV含有3種結(jié)構(gòu)蛋白，即纖突蛋白S、膜蛋白M和核衣殼蛋白N。N蛋白占病毒總蛋白量的40%，主要作用是包裹核酸，與病毒的復制有關(guān)[6]。N蛋白還能免疫識別相關(guān)靶位，在細胞免疫和體液免疫中起作用。在進化過程中N蛋白比S1蛋白相對保守，因此我們通過對N蛋白進行表達，以此作為群特異性診斷抗原，建立了檢測不同IBV抗體水平的間接ELISA診斷試劑盒。自建試劑盒選擇原核表達載體pET-32 a(+)構(gòu)建重組表達質(zhì)粒進行融合表達并純化，解決了IBV全病毒純化困難的問題。檢測雞傳染性支氣管炎病毒抗體的間接ELISA試劑盒，成本低廉、操作簡便、快速，尤其適合批量樣品的檢測，大大提高了雞傳染性支氣管炎血清學診斷的效率[7-10]。

1 材料與方法

1.1 病毒、試劑及藥品

IBV-LC2、表達載體pET32 a、大腸桿菌BL21均為山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所禽病診斷與免疫重點實驗室保存。限制性內(nèi)切酶SalⅠ、EcoRⅤ及Trizol RNA提取試劑購自TaKaRa公司；反轉(zhuǎn)錄酶(AMV)、RNA酶抑制劑及dNTP混合物購自Promage公司；酶標HRP-羊抗雞IgG(工作濃度為1∶3 000)購自SouthernBiotech公司；rTaqDNA聚合酶、DNA分子量標準(Marker)購自寶生物工程(大連)有限公司；IBV ELISA檢測試劑盒購自IDEXX公司，其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.2 IBV N蛋白的擴增及重組表達載體的構(gòu)建

參照GenBank已公布的IBV-LC2N基因(DQ377139)序列，設計一對特異性引物，正鏈引物為5′-CCGATATCATGGCAAGCGGTAAAGCA-3′(EcoRⅤ位點)，負鏈引物為5′-CCGTCGACACTC AAAGTTCATTCTCTCC-3′(SalⅠ位點)，擴增片段大小為1 230 bp。引物合成由生工生物工程(上海)有限公司完成。提取核酸，進行RT-PCR。PCR循環(huán)參數(shù)為：94 ℃變性2 min后，經(jīng)94 ℃ 1 min，50 ℃ 60 s，72 ℃ 2 min，共30個循環(huán)，最后于72 ℃延伸10 min。將載體pET32 a和PCR產(chǎn)物進行EcoR V、SalⅠ雙酶切并回收。用T4 DNA連接酶將二者進行16 ℃過夜連接，轉(zhuǎn)化表達宿主菌感受態(tài)細菌BL21，37 ℃溫箱培養(yǎng)16～20 h。挑取單菌落擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用EcoR V、SalⅠ進行雙酶鑒定。將陽性重組質(zhì)粒送上海博亞生物技術(shù)有限公司測序。

1.3 重組表達質(zhì)粒在宿主菌中的誘導表達

將鑒定為陽性的重組菌接種于4 mL LB(含100 μg·mL-1Amp)試驗培養(yǎng)基中，待37 ℃振蕩過夜，取出1 mL，離心，去上清，菌體接種于100 mL含Amp的 LB(100 μg·mL-1)培養(yǎng)基中。37 ℃ 200 r·min-1振蕩培養(yǎng)至D600=0.6，加IPTG至終濃度為1.0 mmol·L-1，繼續(xù)誘導培養(yǎng)至4 h，10 000 r·min-1離心5 min,收集菌體，加適量裂解緩沖液，于冰浴中超聲破碎，10 000 r·min-1離心5 min，收集上清。加入等體積SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸3～5 min。每孔上樣15 μL，進行SDS-PAGE電泳。用染色液 R-250染色，后放入脫色液中脫色。

1.4 表達產(chǎn)物的Western-blot檢測

將表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳，待電泳分離后，切出含待轉(zhuǎn)膜蛋白的凝膠轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。用含10%小牛血清的PBST洗液浸泡硝酸纖維膜，37 ℃封閉2 h。用洗液1∶100倍稀釋雞抗IBV陽性血清，將硝酸纖維素膜浸泡其中，反應1 h，洗液洗膜3次，每次5 min。加入新配置的DAB顯色液，避光反應15 min。顯色完成后，將硝酸纖維素膜移至蒸餾水中終止顯色。

1.5 表達的融合蛋白的純化

按照His-Bind蛋白純化柱使用說明進行表達蛋白的純化。將破碎好的重組菌進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后取下凝膠，先用雙蒸水洗滌，然后浸入4 ℃預冷的250 mmol·L-1的KCl溶液中顯色5～10 min，最后用雙蒸水洗滌。將目的蛋白條帶切下，放入2 mL的Eppendorf管中，加少量的PBS洗滌數(shù)次，加少量的PBS，用玻璃棒將其搗細，反復凍融數(shù)次，8 000 r·min-1離心10 min，吸取上清，SDS-PAGE電泳進行純度鑒定，核酸蛋白分析儀測定蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE驗證后將純化后的蛋白分裝放入-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 間接ELISA最佳工作濃度及臨界值的確定

用包被緩沖液將IBV N重組蛋白進行倍比稀釋，包被ELISA反應板，每孔80、40、20、10、5、2.5 μg·mL-1包被ELISA反應板，IBV陽性血清和陰性血清經(jīng)大腸桿菌裂解液處理后分別作1∶25，1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，1∶800系列稀釋；進行間接ELISA測定。TMB底物顯色，硫酸終止反應；測定光波長450 nm的D值。在最佳工作條件下，對收集的20份無IBV抗體雞血清進行間接ELISA測定，確定陰陽性臨界值。

1.7 間接ELISA的特異性、重復性試驗和抗原保存期試驗

用IBV-N蛋白建立的間接ELISA方法分別檢測NDV、AIV、EDS-76、IBDV、ILTV等陽性血清及IBV陰性血清進行交叉反應性測定，每樣本2個重復。用2次包被的酶標板，檢測10份IBV陽性血清和10份陰性血清，每個樣品重復檢測5次，測定其變異系數(shù)。純化的重組N蛋白以最佳工作濃度包被封閉后，待其干燥后裝入含干燥劑的包裝袋中4 ℃保存，后隔12個月取出用已知陰陽性血清按所建立的方法進行檢測。

1.8 與IDEXX公司的ELISA試劑盒檢測的對比

臨床應用檢驗的樣品80份。應用自制ELISA試劑盒和進口IDEXX試劑盒同時檢測送檢樣品，比較試劑盒的符合率。

1.9 間接ELISA方法的初步應用

將免疫雛雞所孵出的12日齡的雛雞分別在免疫前、免疫H120后5、9、21和28 d采血，分離血清，間接ELISA測定，分析母源抗體的消長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體的構(gòu)建

陽性重組表達質(zhì)粒經(jīng)EcoR V、SalⅠ雙酶切產(chǎn)生5.9 kb的載體條帶和約1.23 kb的外源基因片段。并將陽性重組表達質(zhì)粒命名為PET32 a-LC2-N。結(jié)果見圖1。測序結(jié)果顯示插入方向正確，插入片斷為 1 230個核苷酸，編碼410個氨基酸。推測IBV-LC2-N蛋白分子量為45.1 ku，融合伴侶分子量為20.4 ku，整個表達融合蛋白為65.5 ku。

1為EcoR V、SalⅠ雙酶切質(zhì)粒pET-LC2-N；2為DNA分子質(zhì)量標準；3為EcoR V、SalⅠ雙酶切質(zhì)粒pET-LC2-N；4為DNA分子質(zhì)量標準圖1 pET32 a-LC2-N重組質(zhì)粒酶切鑒定的結(jié)果

2.2 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE與Western-blotting分析

將含有陽性重組載體的大腸桿菌在IPTG誘導下表達，產(chǎn)物經(jīng) SDS-PAGE檢測，在大約65 ku處可見表達條帶，與預期蛋白大小相一致，而空載體菌誘導后，沒有出現(xiàn)此蛋白條帶(圖2)。將目的蛋白進行純化(圖3)。Western-blotting分析發(fā)現(xiàn)該融合蛋白能與雞抗IBV陽性血清進行反應，具有良好的免疫原性，確定了65.5 ku的蛋白為重組的N蛋白(圖4)。

1為pET-32 a誘導表達4 h；2～6為pET-32 a-IBV-N-BL21誘導表達4 h；7 為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準圖2 重組蛋白的誘導表達

1為純化的重組蛋白；2為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；3～6為純化的重組蛋白圖3 重組蛋白的純化

1為重組蛋白；2為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；3為pET-32(+)空載體圖4 重組蛋白的Western-blot 檢測

2.3 間接ELISA最佳工作濃度及臨界值的確定

間接ELISA方陣實驗結(jié)果(表1)取陽性血清D450在1.0左右，陰性血清D450在 0.297左右，且陽性血清D450/陰性血清D450即P/N值大于2.1的抗原濃度和血清稀釋度為最佳工作濃度，結(jié)果如表1所示。從表1～2可以看出，抗原最佳濃度為20 μg·mL-1，血清最佳稀釋濃度為1∶200。

2.4 間接ELISA的特異性、重復性試驗和抗原保存期的確定

用IBV-N蛋白建立的間接ELISA方法分別檢測NDV、AIV、EDS-76、IBDV、ILTV等陽性血清及IBV陰性血清進行交叉反應性測定，結(jié)果均為陰性，表明該方法與上述病毒無交叉反應。用2次包被的酶標板，檢測10份IBV陽性血清和10份陰性血清，每個樣品重復檢測5次，測定其變異系數(shù)結(jié)果表明，變異系數(shù)最大為4.80%，最小為0.8%。20份血清變異系數(shù)都較小，具有較好的重復性。隔12個月取出用已知陰陽性血清按所建立的方法進行檢測。結(jié)果顯示，包被本發(fā)明的重組N蛋白保存12個月仍可用于檢測。

表1 不同抗原包被量和血清稀釋度對D450值的影響

注：P代表陽性血清；N代表陰性血清。

表2 不同抗原包被量和血清稀釋度對P/N值的影響

2.5 自制ELISA試劑盒與中和進口IDEXX試劑盒的對比

臨床應用檢驗的樣品80份。應用自制ELISA試劑盒和進口IDEXX試劑盒同時檢測送檢樣品，比較試劑盒的符合率。其中自制ELISA試劑盒檢出陽性血清為50份，陽性檢出率為62.5%，進口IDEXX試劑盒檢出陽性血清47份，陽性檢出率為58.75%，2種方法的符合率為96.25%(表3)。

表3 血清樣品的檢測結(jié)果與IDEXX公司的ELISA試劑盒比較

2.6 間接ELISA方法的應用

用該試劑盒對雛雞免疫 IBV H120前及免疫后5、9、21及28 d雞的抗體滴度進行檢測，免疫7 d后開始出現(xiàn)免疫抗體，然后抗體水平不斷升高，到21 d抗體水平達到最高峰，隨后抗體水平逐漸下降，28 d時抗體檢測為陽性，抗體持續(xù)到28日齡(圖5)。

圖5 SPF雛雞免疫后抗體的消長規(guī)律

3 小結(jié)與討論

IBV核衣殼蛋白又稱核蛋白(N蛋白)，具有很好的抗原性和免疫原性，在細胞免疫和體液免疫中起著重要作用。體外表達的N蛋白能引起免疫應答，能使免疫雞增速產(chǎn)生抗IBV抗體，可誘導雞對IBV氣管感染的免疫保護作用。用N蛋白免疫雞后，可激活T輔助細胞，同時可增強B淋巴細胞產(chǎn)生抗體的能力。加上N蛋白具有高保守性，這使得N蛋白及其抗體在IBV診斷方面顯示出優(yōu)勢。核蛋白占病毒總蛋白量大，而且核蛋白為非糖基化蛋白，由于它能檢測群抗體應答，可以作為IBV群特異性診斷抗原。本研究在利用RT-PCR成功獲得了IBVN基因的基礎(chǔ)上，利用原核表達載體pET-32 a成功地表達了N蛋白，并證實了其具有良好的反應原性。以此重組N蛋白建立了N-ELISA，經(jīng)特異性、重復性試驗證實了建立的N-ELISA具有良好的應用價值。

通過自制試劑盒來檢測免疫H120的IBV抗體消長變化，可知，在免疫7 d后，機體開始產(chǎn)生抗體，然后抗體水平不斷升高，到21 d抗體水平達到最高峰，隨后抗體水平逐漸下降，抗體持續(xù)到28 d，符合IBV弱毒疫苗抗體的消長規(guī)律，說明該試劑盒的檢測結(jié)果可以適用于IBV免疫后的抗體水平檢測。自制試劑盒的包被抗原區(qū)別于IDEXX的包被抗原IBV。自建試劑盒檢測血清時做200稀釋。IDEXX試劑盒檢測樣品時,血清樣品是做500倍稀釋，用這2種方法對80份血清樣本進行檢測，比較它們的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，自建試劑盒檢測D值普遍都比IDEXX試劑盒的D值高。出現(xiàn)這樣的差異可能是由于血清稀釋度不同造成的，也可能與2種試劑盒的包被抗原不同有關(guān)。通過比較實驗結(jié)果表明自制試盒質(zhì)量可靠，結(jié)果確實，是一種敏感、快速的臨床檢測方法。但自制試劑盒其成本低，可以用于大批量檢測，是我們急需研制的國產(chǎn)同類試劑盒，以提高我國對IBV的檢測水平[8,11]。

參考文獻：

[1] 劉程. 雞傳染性支氣管炎病毒RT-PCR和RT-LAMP檢測方法的建立 [D]. 成都：四川農(nóng)業(yè)大學，2012：9-23.

[2] BANDE F, ARSHAD S S, OMAR A R, et al. Global distributions and strain diversity of avian infectious bronchitis virus: a review [J]. Animal Health Research Reviews, 2017, 18(1)：70-83.

[3] SEGER W, GHALYANCHI LANGEROUDI A, KARIMI V, et al. Prevalence of avian infectious bronchitis virus in broiler chicken farms in south of Iraq, 2014—2015 [J]. Veterinary Research Forum, 2016, 7(4)：317-321.

[4] ZANATY A, ARAFA A S, HAGAG N, et al. Genotyping and pathotyping of diversified strains of infectiousbronchitis viruses circulating in Egypt [J]. World Journal of Virology, 2016, 5(3)：125-134.

[5] HEMIDA M G, AL-HAMMADI M A, DALEB A H S, et al. Molecular characterization and phylogenetic analyses of virulent infectious bronchitis viruses isolated from chickens in Eastern Saudi Arabia [J]. Virusdisease, 2017, 28(2)：189-199.

[6] 李敏, 李俐睿, 岳建國, 等. 雞傳染性支氣管炎病毒重組N蛋白克隆表達與免疫原性檢測 [J]. 四川畜牧獸醫(yī)，2017, 44(4)：24-27.

[7] MODIRI HAMADAN A, GHALYANCHILANGEROUDI A, HASHEMZADEH M, et al. Genotyping of Avian infectious bronchitis viruses in Iran (2015—2017) reveals domination of IS-1494 like virus [J]. Virus Research, 2017, 240：101-106.

[8] 王俞丹, 楊保收, 陳冰, 等. 雞IBV鑒別診斷ELISA方法的研究 [J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2016(3)：116-117.

[9] SULTANKULOVA K T, KOZHABERGENOV N S, STROCHKOV V M, et al. New oligonucleotide microarray for rapid diagnosis of avian viral diseases [J]. Virology Journal, 2017, 14(1)：69.

[10] BATRA A, MAIER H J, FIFE M S. Selection of reference genes for gene expression analysis by real-time qPCR in avian cells infected with infectious bronchitis virus [J]. Avian Pathology, 2017, 46(2)：173-180. doi: 10.1080/03079457.2016.1235258. Epub 2016 Dec 7.

[11] TSAI C T, TSAI H F, WANG C H. Detection of infectious bronchitis virus strains similar to Japan in Taiwan[J]. Journal of Veterinary Medical Science, 2016, 78(5)：867-871.